[发明专利]一种具有增强子功能的落叶松DNA分子、获取及鉴定方法

说明书

本发明公开了一种具有增强子功能的落叶松DNA分子、获取及鉴定方法。增强子DNA序列如SEQ ID NO.1。用特异引物以日本落叶松的基因组DNA为模板，扩增得到574bp的扩增产物，即得。mini35s启动子单独不能启动的报告基因GFP表达，由于增强子可远距离促进转录的特征，当有功能的增强子插入该载体中后，其可以促进荧光蛋白转录，从而观察到荧光。本发明提供的落叶松增强子序列，本质是DNA分子，574bp，能够促进转录。

技术领域

本发明涉及生物技术，特别涉及一种具有增强子功能的落叶松DNA分子、获取及鉴定方法。

背景技术

落叶松(学名：Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen.)是松科，落叶松属乔木，高达可达35米，胸径达90厘米；幼树树皮深褐色，枝斜展或近平展，树冠卵状圆锥形；冬芽近圆球形，芽鳞暗褐色，边缘具睫毛，基部芽鳞的先端具长尖头。叶片倒披针状条形，先端尖或钝尖，上面中脉不隆起，球果幼时紫红色，成熟前卵圆形或椭圆形，黄褐色、褐色或紫褐色，种子斜卵圆形，灰白色，5-6月开花，球果9月成熟。增强子是一类顺式调控元件，增强子可能位于基因上游，或下游，甚至有时位于另外的染色体上。基因在转录时，染色体结构发生动态的变化，使得序列上相隔很远的增强子和启动子在调控蛋白的协助下相互作用，促进基因的转录。落叶松中增强子的分析与验证，为了解落叶松基因组提供重要的依据。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供具有增强子功能的落叶松DNA分子。

本发明另一目的是提供所述具有增强子功能的落叶松DNA分子的获取方法及鉴定方法。

技术方案：本发明提供一种具有增强子功能的落叶松DNA分子，DNA序列如SEQ IDNO.1。

进一步地，包括如下步骤：用特异引物以日本落叶松的基因组DNA为模板，扩增得到560bp的扩增产物，即得。

进一步地，所述特异引物序列如下：

正向：5’-ggaatatgattaaagataagcggtcacacccttacaaaac-3’；

反向：5’-ctgtcaaacactgatagtttacaagtggaaagctaatgttct-3’。

落叶松RNA-seq：将落叶松针叶和落叶松愈伤组织分别进行转录组测序，对转录本进行注释；ATAC-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行ATAC-seq测序，确定开放染色质信息；组蛋白ChIP-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行H3K27ac ChIP-seq测序，明确H3K27ac的分布特征，整合组学分析结果，预测落叶松中增强子，综合测序数据，通过拼装获得落叶松序列SEQ ID NO.2，该序列中包括一个转录本，增强子位于开放染色质区域，并且与H3K27ac富集相关，能够激活远端基因的表达，将该转录本远端具有开放染色质特征和H3K27ac显著富集的序列扩增(引物同上)，最终获得SEQ ID NO.1。

所述的具有增强子功能的落叶松DNA分子的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)将增强子DNA序列SEQ ID NO.1插入mini35s启动GFP载体中，构建LkENH2增强子载体；

(2)正对照载体采用CaMV35S-GFP，mini35s启动GFP载体为负对照；

(3)落叶松原生质体的制备与转化；

(4)转化后对增强子活性进行荧光验证。

进一步地，所述载体的构建方法：使用限制性内切酶SacI将mini35s启动GFP载体线性化，后用无缝连接试剂盒将其与增强子序列片段连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，得到LkENH2增强子载体。