[发明专利]一种基于重组荧光蛋白探针的致病性弧菌多重快速检测体系和方法

权利要求书

1.一种基于重组荧光蛋白探针的致病性弧菌多重快速检测体系，荧光标记物、引物对和核苷酸探针，其特征在于：所述荧光标记物为通过大肠杆菌表达的重组荧光蛋白，将血红素氧化酶Ho1和藻红胆素合成酶pebS组成一个顺反子，插入pRSFDuet-1的第一个表达框中；链霉亲和素Sa和别藻蓝蛋白apcA基因通过Linker连接为融合蛋白SLA，将裂合酶cpcS基因与融合蛋白SLA基因构成顺反子，插入到pRSFDuet-1的第二个表达框中，将构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过发酵和分离纯化，获得重组荧光蛋白。

2.按权利要求1所述的基于重组荧光蛋白探针的致病性弧菌多重快速检测体系，其特征在于：所述副溶血弧菌的毒力基因(TDH)、霍乱弧菌的肠毒素基因(CTX)、创伤弧菌多重毒素基因(RTX)和溶藻弧菌多重毒素基因(HBP)的扩增引物和核苷酸探针分别为：

副溶血弧菌的毒力基因(TDH)为

上游引物：TDH-F:ATCTGTCCCTTTTCCTGCC；

下游引物：TDH-R:BIOTIN-GACCATAAACATCTTCGTAC；

核苷酸探针：TDH-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTACCCAAGCTCCGGTCAATG；

霍乱弧菌的肠毒素基因(CTX)

上游引物：CTX-F:GGCACGATGATGGATATGTTTCC；

下游引物：CTX-R:BIOTIN-TCTTGTTCATCTGGATGAGG；

核苷酸探针：CTX-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAACTATATTGTCTGGTCA；

创伤弧菌多重毒素基因(RTX)

上游引物：RTX-F:AGAAGGCAATCATACCGCAG；

下游引物：RTX-R:BIOTIN-TGGCTTAAACAAGGTTTGATC；

核苷酸探针：RTX-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGGTGGCTATTCACTCAGC；

溶藻弧菌多重毒素基因(HBP)

上游引物：HBP-F:CACATCATCCATTCGGGCAA；

下游引物：HBP-R:BIOTIN-TGAAATACGTACAAGTTCA；

核苷酸探针：HBP-P:NH2-TTTTTTTTTTTTTCAACCACGGCAACCGCAATGT。

3.一种利用权利要求1所述检测体系的检测方法，其特征在于：运用权利要求1所述中重组荧光蛋白探针、扩增引物、核苷酸探针组成的检测体系实现致病性弧菌的多重快速检测。

4.按权利要求3所述检测体系的检测方法，其特征在于：以待检测样品的DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；将引物对应的核苷酸探针与微球偶联得到微球探针，微球探针上述得到的PCR产物进行孵育得到杂交产物，将杂交产物与重组荧光蛋白温育，检测杂交产物的荧光信号。

5.按权利要求4所述检测体系的检测方法，其特征在于：所述多重PCR反应体系总体积为50μL，包含四对引物各0.5μL(0.1μmol/L)，DNA模板1μL，TE缓冲液为阴性对照，反应程序为94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃5min。

6.按权利要求4所述检测体系的检测方法，其特征在于：将5uL PCR产物，加入到20μL含有微球探针的杂交液中，混匀后在95℃下进行5min的DNA双链变性，然后在49℃条件下，进行30min的杂交反应。

7.按权利要求4所述检测体系的检测方法，以阴性对照样品荧光值的3倍为截止值，荧光值大于截止值判定为阳性样品，低于截止值判定为阴性样品。