[发明专利]新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.新流法腺四联病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、目的基因的优化及合成

根据昆虫细胞密码子偏好性对NDV NA-1株的M基因和F基因、H9N2 AIV株的HA基因、IBDSH99株的VP2基因、HB 1510株的Fiber-2基因进行密码子优化；M基因优化后序列如SEQ IDNO.1所示；F基因优化后序列如SEQ ID NO.2所示；HA基因优化后序列如SEQ ID NO.3所示；VP2基因优化后序列如SEQ ID NO.4所示；Fiber-2基因优化后序列如SEQ ID NO.5所示；

步骤二、重组穿梭质粒的构建

根据各基因优化后序列和pFastbac-1载体信息设计特异性引物和M13鉴定引物，利用PCR进行基因扩增及鉴定，将合成的各个质粒分别进行双酶切并利用胶回收试剂盒回收目的片段，将各目的片段分别连接至pFastbac1载体，转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中进行PCR及双酶切筛选，最终获得重组穿梭质粒pFastbac1-M、pFastbac1-F、pFastbac1-GPI-HA、pFastbac1-GPI-VP2和pFastbac1-GPI-Fiber-2；

步骤三、重组杆粒的构建

将步骤二构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，涂板于三抗固体选择平板，37℃过夜培养，挑取纯净白斑，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板，反复筛选，直至阳性率为100％，最终获得重组杆粒rBacmid-M、rBacmid-F、rBacmid-GPI-HA、rBacmid-GPI-VP2和rBacmid-GPI-Fiber-2；

步骤四、重组杆状病毒的拯救

采取脂质体介导转染方式，将步骤三构建的各重组杆粒分别转染至昆虫杆状病毒表达系统中，盲传三代收获上清，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，最终获得重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2和rBV-GPI-Fiber-2；

步骤五、嵌合病毒样颗粒的制备及纯化

将步骤四构建的重组杆状病毒rBV-M、rBV-F、rBV-GPI-HA、rBV-GPI-VP2和rBV-GPI-Fiber-2按照总MOI＝5的比例接种至昆虫杆状病毒表达系统中，收集细胞上清；采用蔗糖密度梯度进行纯化，最终获得嵌合病毒样颗粒NDV-AIV-IBDV-FAdV4 cVLPs。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，根据pFastbac-1载体信息分别在HA基因、VP-2基因和Fiber-2基因依次引入蜂素信号肽序列、HIS标签序列、TEV切割序列和GPI信号肽序列。