[发明专利]基于TCR/BCR高通量测序的特定淋巴细胞含量分析方法及装置

权利要求书

1.一种非诊断治疗用途的基于TCR/BCR高通量测序的特定淋巴细胞含量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)高通量测序：提取待测生物样品的基因组DNA，获得所提取的DNA的总质量X，向其中投入预定量R条人工合成的TCR/BCR编码基因内标序列，得加标样本，将此加标样本进行高通量测序；所述高通量测序步骤中，通过以下方法对加标样本进行高通量测序：

TCR/BCR基因片段富集：向提取的DNA中加入多重PCR扩增引物，以及预定量R条人工合成的TCR/BCR编码基因内标序列，对TCR/BCR基因片段进行扩增，富集TCR/BCR基因片段；所述多重PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.56所示；

文库构建：取上述反应产物，构建文库；

高通量测序：对上述文库进行高通量测序；

所述多重PCR扩增引物序列按照以下比例投入：

2)数据分析：获取上述高通量测序数据，分析得到的TCR/BCR基因序列，拆分得到内标序列数量Nr和待测样本TCR/BCR基因序列数量Ns；根据投入的内标序列R与测序后检出内标序列数量Nr，计算扩增倍数Mn；将所述待测样本TCR/BCR基因序列与目标淋巴细胞抗原受体基因序列A进行对比，得到与目标淋巴细胞抗原受体基因序列A一致的原始抗原受体基因序列数量Na1、目标淋巴细胞抗原受体基因发生测序错误的序列数量Na2、目标淋巴细胞抗原受体基因发生二次重排的序列数量Na3、目标淋巴细胞抗原受体基因发生突变的序列数量Na4，以Na1、Na2、Na3和Na4的总和作为目标淋巴序列总数Na；通过目标淋巴序列总数Na和扩增倍数Mn计算得到含有目标淋巴细胞数量M，即得；

所述目标淋巴细胞抗原受体基因发生测序错误的序列通过以下方法确定：

通过序列比对，得到与序列A具有相同V和J基因的VJ一致序列，将上述VJ一致序列的CDR3区域与序列A进行两两碱基比对，当所述VJ一致序列CDR3区域与序列A的差异碱基数小于等于差异阈值，且不一致的碱基测序质量值小于等于测序质量阈值，则将该VJ一致序列判定为目标淋巴细胞抗原受体基因发生测序错误的序列，数量计为Na2；

所述目标淋巴细胞抗原受体基因发生二次重排的序列通过以下方法确定：

通过序列比对，得到与序列A具有相同J基因的J一致序列，确定此J一致序列的CDR3区域的V基因部分和非V基因部分，分析该J一致序列上CDR3区非V基因序列与序列A上CDR3区非V基因序列的一致性，当该J一致序列的非V基因部分序列与序列A的非V基因序列一致，且该J一致序列的V基因是序列A的V基因的上游基因片段，则将该J一致序列判定为目标淋巴细胞抗原受体基因发生二次重排的序列，数量计为Na3；

所述目标淋巴细胞抗原受体基因发生突变的序列通过以下方法确定：

通过序列比对，得到与序列A具有相同V基因、J基因且CDR3长度一致的TCR/BCR基因序列，将其与序列A上的CDR3序列进行两两比对，选取与序列A上的CDR3序列相似度超过预定阈值的序列集，将此序列集中各序列进行多序列比对，构建进化树；并且将此序列集中的序列与序列A的V，D，J基因序列比对，确定每条序列的突变位点，将突变率最少的序列作为进化树的根，确定序列A在进化树上的位置，进化树中序列A之后的进化分支的序列即为目标淋巴细胞抗原受体基因发生突变的序列，数量计为Na4；

所述含有目标淋巴细胞数量M通过以下公式计算得到：M＝Na/Mn。

2.根据权利要求1所述的非诊断治疗用途的基于TCR/BCR高通量测序的特定淋巴细胞含量分析方法，其特征在于，以所提取的DNA的总质量X除以单个细胞的基因组平均重量，得到样品总细胞数N，待测生物样本中目标淋巴细胞的相对含量y通过以下公式计算得到：y＝M/N×100％。

3.一种基于TCR/BCR高通量测序的用于检测淋巴造血细胞肿瘤微小残留含量的检测试剂盒，包括：

内标序列：人工合成TCR/BCR的编码基因内标序列；

多重PCR扩增引物：如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.56所示TCR/BCR基因扩增引物；所述多重PCR扩增引物的使用比例如下：

4.一种基于TCR/BCR高通量测序的用于检测淋巴造血细胞肿瘤微小残留含量的检测装置，包括：

高通量测序模块：包括权利要求3所述试剂盒中的多重PCR扩增引物，该高通量测序模块用于提取待测生物样品的基因组DNA，获得所提取的DNA的总质量X，向其中投入预定量R条人工合成的TCR/BCR编码基因内标序列，得加标样本，将此加标样本按照权利要求1所述的方法进行高通量测序；

数据分析模块：用于获取上述高通量测序数据，该数据分析模块包括含有按照权利要求1的方法所述逻辑计算的介质，计算得到含有目标淋巴细胞数量M，所述目标淋巴为淋巴造血细胞肿瘤微小残留细胞。