[发明专利]基于TCR/BCR高通量测序的特定淋巴细胞含量分析方法及装置

说明书

本发明涉及一种基于TCR/BCR高通量测序的特定淋巴细胞含量分析方法及装置，属于基因检测技术领域。该分析方法包括以下步骤：高通量测序：提取待测生物样品的基因组DNA，投入预定量人工合成的TCR/BCR编码基因内标序列，进行高通量测序；数据分析：获取上述高通量测序数据，分析得到的TCR/BCR基因序列，根据投入的内标序列计算扩增倍数；将待测样本TCR/BCR基因序列与目标淋巴细胞抗原受体基因序列A进行对比，得到与目标淋巴细胞抗原受体基因序列A一致的原始抗原受体基因序列数量、发生测序错误的序列数量、发生二次重排的序列数量、发生突变的序列数量，得到目标淋巴序列总数；通过目标淋巴序列总数和扩增倍数计算得到含有目标淋巴细胞数量，可精确确定每个T/B细胞的含量。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于TCR/BCR高通量测序的特定淋巴细胞含量分析方法及装置。

背景技术

适应性免疫又称获得性免疫，特异性免疫细胞主要包括参与细胞免疫的T淋巴细胞和参与体液免疫的B淋巴细胞。适应性免疫具有抗原特异性和免疫记忆的特点，其抗原特异性是指不同的抗原需要由不同的淋巴细胞进行识别和应答。在临床实践中，经常需要对生物样品中特定淋巴细胞的含量进行测定(生物样品中各成分组成如图1所示)，例如可通过检测是否有特定疫苗特异性的免疫细胞，来确定疫苗的免疫效果；或者对血液肿瘤的治疗后残留肿瘤细胞的检测等。

而对于淋巴细胞含量测定，目前一般有两种方法可以定量生物标本中特定淋巴细胞的含量。第一种方法是流式细胞术，由于不同的血细胞表面的分化抗原不同，例如干细胞表面表达CD34分子，髓系细胞表达CD14、CD13，B细胞表达CD10、CD20、CD19，T细胞系表达CD2、CD5等。流式细胞术可以根据抗淋巴细胞表面的细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体，通过荧光染色，测定淋巴细胞的表面抗原的表达情况，从而判断出待检测细胞的属性。

第二种方法是针对淋巴细胞表面抗原受体，用特异性引物进行实时定量PCR检测(RQ-PCR)。淋巴细胞的抗原特异性是由T淋巴细胞表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)和细胞表面的B细胞受体(B cell receptor，BCR)或称抗体(immunoglubin，IG)的抗原识别特异性决定的。TCR/BCR是由T/B细胞基因组上的TCR/BCR基因所编码的。在T/B细胞发育过程中，TCR和BCR的基因会进行VDJ的重排，这种重排机制导致每个T/B淋巴细胞都具有不同的TCR和BCR，因而可以用TCR/BCR作为不同T/B细胞的标志物，来准确的区分每一个T/B细胞。

然而，通过流式细胞术检测，检测的是表面分化抗原相同的一类细胞的含量，并不能准确的区分每个细胞。且目前常见的流式细胞术的检测灵敏度只可达到到1/10000，对于含量低于1/10000的样品，会给出假阴性的检测结果。而在流式细胞术中，数据解读依赖于操作者和实验室，标准化程度低。最为重要的是，对于发生癌变的淋巴细胞，其表面抗原的表达在癌症发生和治疗的不同时间会发生变化，会严重影响癌细胞检测的准确性。

通过RQ-PCR进行检测，又需针对不同的目标细胞的TCR/BCR基因，设计特异性引物和定量探针，具有操作繁琐，耗时长，成本高的缺陷，且如果目标细胞TCR/BCR基因的定量探针结合区域发生了突变或者二次重排，则会发生漏检。

据此，科学家们也采用通过高通量测序的方式，针对目标细胞TCR/BCR基因进行检测，但是，目前针对TCR/BCR的高通量测序，又往往由于基因产生突变而导致具有检测偏差。并且，基于多重PCR方法的TCR/BCR研究会由于多重PCR引物体系中引物的结合效率差异及引物之间的相互作用的影响造成很大的扩增偏好，如果不对体系进行优化校正则不能准确反映出样本克隆的真实水平。且基于RACE方法的TCR/BCR研究由于只适用于RNA样本，对样本采集及运输条件较为严苛。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种基于TCR/BCR高通量测序的特定淋巴细胞含量分析方法，采用该分析方法，能够精准定量检测特定目标淋巴细胞，真实反映样本克隆水平。