[发明专利]一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法

权利要求书

1.一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)选取三种目标化合物

三种目标化合物分别为：吡哆醛；5-甲基四氢叶酸；甲钴胺；

2)利用同位素内标法进行定量，以目标化合物与其同位素内标的浓度比为X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素的含量；

3)蛋白沉淀剂按照如下方法配制得到：分别移取10μL 100μg/mL吡哆醛-d3、10μL 100μg/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、20μL 10μg/mL甲钴胺-d3，加甲醇定容至1mL，配制成混合内标液，再准确移取100μL混合内标液，用50％甲醇乙腈定容至10mL，配制成内标浓度分别为10.0ng/mL吡哆醛-d3、10.0ng/mL 5-甲基四氢叶酸-d5、2.0ng/mL甲钴胺-d3蛋白沉淀剂；

4)血清样本的前处理：

4.1)准确移取200μL血清样本，加入含有三种内标的蛋白沉淀剂500μL，涡旋混匀3min，再加入600μL 80％正己烷/乙酸乙酯，v/v，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；

4.2)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入溶剂溶解，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100μL于96孔样品板中，上机检测；

5)标准曲线的配制与处理

5.1)分别准确称取10.0mg吡哆醛、10.0mg 5-甲基四氢叶酸、10.0mg氰钴胺、10.0mg甲钴胺，分别加入10mL甲醇、10mL含1％VC甲醇，v/v、10mL甲醇、10mL甲醇，配制成浓度分别为1.0mg/mL吡哆醛母液、1.0mg/mL5-甲基四氢叶酸母液、1.0mg/mL氰钴胺母液、1.0mg/mL甲钴胺母液；

5.2)分别移取100μL 1.0mg/mL吡哆醛，用50％甲醇水定容至1mL得到100.0μg/mL吡哆醛中间液；移取100μL 1.0mg/mL 5-甲基四氢叶酸，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL 5-甲基四氢叶酸中间液；移取10μL 1.0mg/mL甲钴胺，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL甲钴胺中间液；

5.3)分别从上述吡哆醛中间液、5-甲基四氢叶酸中间液、氰钴胺中间液、甲钴胺中间液10μL、10μL、10μL、10μL，用甲醇定容至1mL，得到混合标准液A；

5.4)混合标准液A用50％甲醇稀释得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为5/10/25/50/100/250/500/1000、5/10/25/50/100/250/500/1000、1/2/5/10/20/50/100/200ng/mL的标准曲线中间液；

5.5)吸取标准曲线中各个浓度标准曲线中间液用5％BSA/PBS，v/v，稀释10倍，得到吡哆醛/5-甲基四氢叶酸/甲钴胺浓度分别为0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.1/0.2/0.5/1/2/5/10/20ng/mL的标准曲线；

5.6)准确移取200μL标准曲线各浓度点，加入含有3种内标的蛋白沉淀剂500μL，再加入600μL 80％正己烷/乙酸乙酯，v/v，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心10min；

5.7)取中间层500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入溶剂溶解，涡旋混匀3min，于4℃，15000rpm离心2min；取100μL于96孔样品板中，上机检测；

步骤2)中使用的仪器条件为：

高效液相色谱条件：

流动相A：0.1％甲酸+纯水；

流动相B：0.1％甲酸+50％乙腈甲醇；

色谱柱型号：Waters UPLC HSS PFP，2.1mm*50mm,1.7μm+在线过滤器；

柱温：40℃±5℃；进样量：15μL；进样盘温度：10℃±5℃；流速为0.3mL/min；

梯度洗脱程序如下：

时间，min	流速，mL/min	A％	B％	Curve
Initial	0.300	99.0	1.0	Initial
1.0	0.300	99.0	1.0	6
1.2	0.300	85.0	15.0	6
4.0	0.300	30.0	70.0	6
4.9	0.300	2.0	98.0	6
4.95	0.300	99.0	1.0	6
5.5	0300	99.0	1.0	6

质谱条件：

离子化模式：电喷雾正负离子切换；采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流速：650L/Hr。