[发明专利]一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法

说明书

本发明公开了一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，步骤如下：1)选取三种目标化合物：吡哆醛；5‑甲基四氢叶酸；甲钴胺；2)以目标化合物与其同位素内标的浓度比为X轴，目标化合物与其同位素内标的峰面积比为Y轴，建立校正曲线，计算上述三种水溶性维生素的含量；3)蛋白沉淀剂配制；4)血清样本的前处理；5)标准曲线的配制与处理。运用蛋白沉淀与液液萃取相结合的前处理方式对血清样本处理，一方面使样本中蛋白质变性沉降得以去除，另一方面脂类杂质得到去除，使处理后的样本在检测过程中受较少基质的干扰；运用相对简便的前处理方式，及快速的检测方法，建立一种能同时检测多种水溶性维生素代谢产物。

技术领域

本发明涉及一种测定血清中多种水溶性维生素代谢产物的同位素的液相色谱质谱联用方法，尤其涉及一种测定血清中多种水溶性维生素代谢产物的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法。

背景技术

水溶性维生素(water-soluble vitamins)是能在水中溶解的一组维生素，是辅酶或辅基的组成部分。主要包括在酶的催化中起着重要作用的B族维生素，其代谢产物含量是判断人体健康水平的重要依据。如维生素B6又叫吡哆素，在蛋白质的代谢过程中起调控作用，它有助于能量的产生，让人感觉精力充沛，被称为提神营养素，吡哆醛是维生素B6的主要代谢产物，是在肝脏醛氧化酶的作用下产生的。5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性和功能的形式，是叶酸参与生理代谢的唯一途径，也是出现在动物血浆和细胞游离叶酸存在的唯一形式，主要用于药物活性成分和食品添加剂，有预防胎儿神经管缺陷、动脉硬化，治疗巨幼红细胞性贫血，增强氟化嘧啶的治疗效果，治疗例如牛皮癣和风湿性关节炎的自身免疫疾病。甲钴胺为维生素B12衍生物，通过化学结构命名，应该叫“甲基维生素B12”，其甲基化的官能基团可参与机体生化过程中的甲基转移活动，对神经组织的核酸、蛋白质和脂肪代谢有促进作用，可刺激雪旺氏细胞卵磷脂合成，修复损伤髓鞘，改善神经传导速度，可直接进入神经细胞，并刺激轴突受损区再生，刺激神经细胞的蛋白质合成，加强轴突的合成代谢，防止轴突变性，参与核酸合成，促进造血机能。

目前，有关水溶性维生素代谢产物的检测方法有很多种，如微生物检测法、ELISA、放射免疫分析，蛋白质结合或生物传感器等方法。微生物检测方法适用于检测多种衍生物的总和(如总叶酸)，其它方法在代谢物的区分上存在相同的缺点。而液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)能够区分开天然维生素及其代谢产物，灵敏度高，特异性强，非常适用于血清或血浆中多种水溶性维生素代谢产物的检测。但是，目前的LC-MS/MS技术检测水溶性维生素时仍然存在诸多问题，如灵敏度不够、前处理复杂和样本用量大等。

CN201910387449.0阐明了“一种多种水溶性维生素含量的测定方法”，采用LC-MS法对血样中5种水溶性维生素进行了检测，缺乏对指标的明确化说明，且对方法中的验证数据相对较少，仅进行了线性说明。

CN 201910837920.1发明名称“一种检测血液中水溶性维生素的方法”，采用LC-MS法对血样中11种水溶性维生素进行了检测，该专利虽然所分析的维生素较多，但仅使用的蛋白沉淀去除蛋白和基质能力较差，且一针分析时间为 15min，在临床检测中难以应用。

发明内容

水溶性维生素的代谢物是一类庞大而复杂的家族，不同代谢产物的化学性质和极性差异较大。因此，将几类样品前处理技术联用，如蛋白沉淀与液液萃取相结合，既能提高待测物的纯化效果，又能提高检测的灵敏度和重现性，非常适合临床复杂样本的分析，本发明的目的正是在于提供这样一种准确性好、灵敏度高的测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

一种测定同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，该方法包括如下步骤：

1)选取三种目标化合物

三种目标化合物分别为：吡哆醛(PL，吡哆醛)；5-甲基四氢叶酸(5-甲基四氢叶酸)；甲钴胺(MeB12，甲钴胺)；