[发明专利]耳聋单倍型基因突变无创检测方法

权利要求书

1.一种用于无创产前检测耳聋基因突变的非诊断方法，其特征在于，所述方法步骤包括：

（1）从孕妇及其丈夫的白细胞中获取基因组DNA，从孕妇血浆中获取游离DNA；

（2）将孕妇及其丈夫的基因组DNA分配到不同的油滴微粒中，利用GemCode平台对长片段序列进行扩增引入barcode序列以及测序接头引物；得到产物片段化、末端修复、连接接头及PCR富集形成二代测序文库；

（3）以孕妇血浆游离DNA制备文库；

（4）将步骤（2）和（3）制备的文库以特异性探针捕获杂交；

（5）捕获文库通过二代测序平台进行高通量测序，得到测序原始数据；

（6）原始数据经过滤、除去低质量、接头序列得到clean数据后，通过分析父母双方的单倍型及胎儿遗传信息，进而确定胎儿的基因型；

所述耳聋基因突变为GJB2和SLC26A4基因突变；

其中步骤（4）中的探针设计方法为：获取GJB2、SLC26A4基因全长并向上下游各延伸1Mb，采用RepeatMask软件分析去掉重复序列，从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针，再一次往后移动n个碱基，截取78bp的序列做探针，直到最后一个78bp；同时根据参考序列中GC含量的不同，调整探针的密度，探针的密度根据密度公式调整；根据GC含量调整探针密度公式：

其中代表某GC含量的探针密度，a 代表GC含量为50%时候的探针密度，为20；gc 代表GC含量；

其中所述探针有生物素标记；

其中步骤（6）包括：

（A）孕妇血浆的原始数据切除接头序列、低质量碱基、过滤小片段并比对到参考基因组的相应位置；

（B）完成（A）后，去除由于PCR扩增偏好引起的重复序列，分析数据，得到单核苷酸变异和插入缺失突变相关信息；

（C）对所有的SNP和INDEL进行注释，然后筛选掉正常人数据库所有的SNP和INDEL进行注释，然后筛选掉正常人数据库，对错义突变和剪切位点改变进行致病性预测；

（D）用10X数据分析软件longranger分别对父母双方的10X数据进行比对，得到父母双方的突变信息；

（E）胎儿基因组遗传突变分析；

其中步骤（E）包括：

（a）父母10X数据按照位点进行合并分类并统计单倍型区域；

（b）计算胎儿DNA浓度；

（c）母系遗传单倍型分析：根据得到的父母单倍型信息，筛选包含目标基因的单倍体区域，采用基于序贯概率比检验分类的RHDO算法推导胎儿遗传母亲的单倍型；通过估计等位基因之间的剂量平衡性，确定目标基因区域遗传的单倍型块；计算胎儿遗传单倍体块的阈值公式如下：

其中

1200为优势比；为当胎儿遗传母亲HapII时，HapI等位基因占比；为当胎儿遗传母亲的HapI时，HapI等位基因占比；

当α型SNP进行RHDO分析时，，，其中f为胎儿浓度；备择假设是母亲血浆中HapI含量过多；当β型SNP进行RHDO分析时，，；备择假设是母亲血浆中HapI含量过少；RHDO分析在目标基因突变位点所在单倍型体积累SNP 深度的计数，直到突变位点的单倍型被分类；

（d）父系遗传单倍型分析

为分析父系遗传的单倍型，提取母亲纯合父亲杂合的SNP；根据这些具有父亲特异遗传信息的位点，统计母亲血浆中这些位点的突变信息，得出父亲遗传的单倍型；其中计算胎儿DNA浓度方法为：

胎儿特异性等位基因读数计算胎儿DNA浓度:

通过统计母亲血浆中第一类点和第三类点等位基因频数，分别进行胎儿DNA浓度的计算，即统计父母同为纯合但等位基因不同的位点或父亲杂合，母亲纯合的位点等位基因的读数进行计算；

计算公式：

其中p为父亲遗传胎儿单倍型的等位基因计数，q为母亲与胎儿共享的等位基因计数；

或者伽马分布模拟胎儿DNA浓度：

提取母亲血浆VCF文件中突变频率小于等于0.25的低频突变；采用最大似然估计的方法，使用所有的突变频率≤0.25或≥0.75的位点进行gamma分布拟合，确定最优的gamma分布函数，其中最大似然估计定义为：

xi是突变频率值，f(.|)是待估计的密度分布函数—gamma密度分布函数，使用R语言来拟合gamma函数，求得gamma分布的期望值，期望值为胎儿DNA浓度。