[发明专利]耳聋单倍型基因突变无创检测方法

说明书

本申请提供了以孕妇及其丈夫的白细胞的基因组DNA和孕妇的血浆游离DNA检测胎儿耳聋单倍型基因突变的无创检测方法，其中利用GemCode平台将孕妇及其丈夫的基因组DNA制备二代测序文库并将孕妇血浆游离DNA制备文库；以特异性探针捕获杂交；捕获文库通过二代测序平台进行高通量测序，得到测序原始数据；原始数据经过滤、除去低质量、接头序列得到clean数据后，通过分析父母双方的单倍型及胎儿遗传信息，进而确定胎儿的基因型。

技术领域

本申请属于分子生物学诊断领域，具体地，本申请提供了以孕妇及其丈夫的白细胞的基因组DNA和孕妇的血浆游离DNA检测胎儿耳聋单倍型基因突变的无创检测方法。

背景技术

听力障碍是人类常见的出生缺陷之一，其发病率约0.1%-0.3%。在中国，携带耳聋基因突变的人群达到7000-8000万，每年还新增6-8万耳聋新生儿。

耳聋病因复杂，可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素（如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等）或基因和环境两者共同作用而致。60%的耳聋是由耳聋基因突变导致的遗传性耳聋，其中约70%变异来自于GJB2、SLC26A4、GJB3及线粒体DNA12SrRNA等4个热点基因。大约21.01%的耳聋患者携带GJB2基因突变,是最常见的致聋因素，可导致先天性重度、极重度聋;SLC26A4基因突变是第二大致聋因素，可引起大前庭导水管综合征性耳聋，其突变检出率达12.7%；此外还有4.51%的耳聋患者携带线粒体12SrRNA基因突变，为药物性耳聋患者常见致病变异。

耳聋遗传方式多样，有常染色体隐性、常染色体显性、伴性遗传等，临床上以常染色体隐性遗传多见。GJB2、SLC26A4大部分病例表现为隐性遗传，即基因的纯合或复杂合突变可能导致先天性耳聋或渐进性耳聋，而单个杂合突变则为耳聋基因携带者。GJB2、SLC26A4携带者将来生育时如果配偶也为相同的 基因携带者，将有25%的概率造成后代先天性耳聋，有50%概率造成后代为耳聋基因携带者。因此，对孕前或孕期夫妇进行耳聋基因变异筛查、对孕妇进行产前诊断可以提早得知生育患病儿的风险，从根本上阻断耳聋出生缺陷的发生，可以有效降低先天性耳聋患儿的出生，做到优生优育。

传统的耳聋基因产前诊断主要通过羊膜腔穿刺术(简称羊穿)、绒毛穿刺术或脐带血穿刺术等有创操作获取胎儿细胞进行检测, 为侵入性产前诊断。侵入性产前诊断虽然准确度高，但存在约1%的流产风险。

1997年，Lo等在妊娠男性胎儿孕妇的外周血中检测到Y染色体性别决定基因，证实孕妇外周血中存在cffDNA。cffDNA主要来源于胎盘合体滋养层细胞，以小片段DNA形式存在，cffDNA的浓度随孕周的增加而增大，可达20%。基于cffDNA这一特性的无创产前检测（NIPT）技术应用而生，NIPT对于胎儿21/18/13三体的检测，因其方法的高灵敏度、高准确度已经普遍用于临床，并逐步向其他染色体异常检测扩展。目前绝大多数单基因病的无创检测都需要依赖于先证者的样本来构建胎儿的单倍体型，从而判断胎儿是否患有单基因遗传病。这在极大程度上限制了无创单基因病检测成为一种临床筛查技术。

综上所述，寻找一种非侵入性且准确度高的产前检测耳聋耳基因突变的方法是非常必要的。

发明内容

为解决上述问题，发明人尝试避免取先症儿样本的步骤，仅使用孕妇及其丈夫的样本来获取胎儿基因型，建立了相应检测方法。

一方面，本申请提供了一种用于无创产前检测耳聋基因突变的方法，其特征在于，所述方法步骤包括：

（1）从孕妇及其丈夫的白细胞中获取基因组DNA，从孕妇血浆中获取游离DNA；