[发明专利]一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两对巢式PCR引物，所述两对巢式PCR引物的序列如下：

F1：5’-CAGAAGGACCGATTCAACTCACT-3’；

R1：5’-CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA-3’；

F2：5’-CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT-3’；

R2：5’-CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg^2＋溶液和ddH₂O。

3.两对巢式PCR引物在制备检测待测样品中是否含有大口黑鲈双RNA病毒试剂盒中的应用，其特征在于，所述两对巢式PCR引物的序列如下：

F1：5’-CAGAAGGACCGATTCAACTCACT-3’；

R1：5’-CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA-3’；

F2：5’-CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT-3’；

R2：5’-CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG-3’。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，采用所述检测待测样品中是否含有大口黑鲈双RNA病毒试剂盒对待测样品进行二轮PCR，具体包括以下步骤：

（1）取待测样品提取RNA；

（2）将RNA反转录得到cDNA；

（3）以cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，第一轮PCR扩增引物为F1和R1；

（4）凝胶电泳，观察第一轮PCR产物中是否存在长度为418bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染；

（5）第一轮PCR扩增结束后，若凝胶电泳无条带，则以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增引物为F2和R2；

（6）凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为339bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第一轮PCR扩增体系为：Green TaqMix 10µL，F1和R1各0.4µL，DEPC水7.2µL，cDNA模板2µL。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第一轮PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第二轮PCR体系为：Green Taq Mix 10µL，F2和R2各0.4µL，DEPC水7.2µL，PCR产物模板2µL。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第二轮PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。