[发明专利]一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法

说明书

本发明涉及双RNA病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法。本发明的试剂盒包括两对巢式PCR引物，所述两对巢式PCR引物的序列如下：F1：5’‑CAGAAGGACCGATTCAACTCACT‑3’；R1：5’‑CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA‑3’；F2：5’‑CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT‑3’；R2：5’‑CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG‑3’。本发明针对LBBV，以其VP1基因保守序列为靶标，建立巢式PCR检测方法，为该病毒病的早期预警及有效防控提供快速灵敏的检测手段。

技术领域

本发明涉及双RNA病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，隶属于太阳鱼科(Centrarchidae)、黑鲈属(Micropterus)。肉质鲜美细嫩，无肌间刺，营养丰富，是一种优质淡水鱼类。发明人从发病的大口黑鲈组织中分离得到一株新型的双RNA病毒，主要临床症状为肠道充满黄色黏液、肝脏出血、有腹水；病毒无囊膜，具有二十面体结构；基因组由双节段双链RNA构成，A节段分别编码VP2、VP4、VP3四种蛋白，B节段编码VP1蛋白；基因同源性分析显示，该病毒与双RNA病毒科(Birnaviridae)的黑鱼斑点病毒属(Blosnavirus)病毒同源性较高，暂命名为大口黑鲈双RNA病毒(Largemouth bass birnavirus,LBBV)。

自19世纪以来，水产动物双RNA病毒病频繁暴发，其代表种传染性胰脏坏死病(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)已在我国山西、甘肃、辽宁、四川等地流行，患病稚鱼死亡率高达95％，给我国水产养殖业带来巨大损害。徐晔、Rodriguez Saint-Jean等人就曾针对水生动物双RNA病毒建立了qRT-PCR检测方法。而本发明对象为一株未知的水生动物双RNA病毒，目前为止，尚未有关于此种病毒的检测方法发表。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法。本发明针对LBBV，以其VP1基因保守序列为靶标，建立巢式PCR检测方法，为该病毒病的早期预警及有效防控提供快速灵敏的检测手段。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒，所述试剂盒包括两对巢式PCR引物，所述两对巢式PCR引物的序列如下：

F1：5’-CAGAAGGACCGATTCAACTCACT-3’；

R1：5’-CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA-3’；

F2：5’-CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT-3’；

R2：5’-CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG-3’。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg²⁺溶液和ddH₂O。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述引物F1/R1和F2/R2的添加量分别为4pmol。

当引物F1/R1和F2/R2的添加量分别为4pmol时，扩增产物条带最亮且无引物二聚体，当引物量大于4pmol时，引物二聚体随着引物量的增加而增加，且目的条带亮度减弱，因此最佳引物添加量为4pmol。

本发明还提供所述试剂盒检测大口黑鲈双RNA病毒的方法，包括以下步骤：

(1)取待测样品提取RNA；

(2)将RNA反转录得到cDNA；