[发明专利]一种人胎盘间充质干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，其特征是：具体包括以下步骤：

S1、获取人胎盘间充质干细胞，采用酶直接消化法从胎盘组织中提取间充质干细胞后进行传代培养，获得P4代人胎盘间充质干细胞，并干细胞专用无血清培养基对获得的P4代人胎盘间充质干细胞进行传代培养；

S2、细胞换液，在对P4代人胎盘间充质干细胞进行传代培养过程中，定时观察细胞，并每隔2天进行细胞换液；

S3、细胞传代冻存，在进行传代培养的人胎盘间充质干细胞的融合度达到80-90％时，对人胎盘间充质干细胞进行传代冻存；进行细胞冻存的具体方法为：

1)采用紫外光对超净台提前照射30min，并将无血清培养基、带血清培养基和胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min；

2)吸出培养瓶中的培养基，采用2mlPBS将其清洗两次；

3)吸出PBS，并向培养瓶中加入1ml胰蛋白酶；

4)旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态；

5)向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应，并进行第一次吹打混合后(10次左右)吸取15ml细胞悬液转移至离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作；

6)弃去离心管中的上清，加入1ml无血清培养基，在吹打混合(15次左右)后，采用移液枪取900ul细胞悬液于冻存管，并加100ul DMSO，再次进行吹打混合，然后进行封口膜封口，并立即放入程序降温盒中，保存温度为-80摄氏度，在程序降温盒中保存一夜后，将其放入液氮罐中保存；

其中，在对人胎盘间充质干细胞进行冻存时，对细胞进行计数。

2.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，其特征是：步骤S3中所述的细胞计数的具体方法为：

a、采用紫外光对超净台提前照射30min，并将无血清培养基、带血清培养基和胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min；

b、吸出培养瓶中的培养基，采用2mlPBS将其清洗两次；

c、吸出PBS，并向培养瓶中加入1ml胰蛋白酶；

d、旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态；

e、向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应，并在进行吹打混合后(10次左右)吸取15ml细胞悬液转移至离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心，其中，离心的转速为1000rpm，温度为24℃，时间为8min；

f、弃去离心管中的上清液，加入1ml培养基，并对其进行吹打混合(15次左右)；

g、在进行吹到混合后，采用移液枪取10ul细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数，其中，分别计数4个16小方格的细胞数量，并取其平均数，细胞密度为该平均数乘以10⁴。

3.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，其特征是：步骤S3中的步骤5)中所述的离心操作的离心的转速为1000rpm，温度为24℃，时间为8min。

4.根据权利要求2所述的一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，其特征是：步骤S3中所述的细胞计数的具体方法还包括：在进行细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其重新接种于25T的培养瓶中。

5.根据权利要求4所述的一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，其特征是：所述接种的密度为50％。

6.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，其特征是：步骤S3中所述的带血清培养基为含血清的DMEM培养基。