[发明专利]基于四面体三脚架辅助的多发夹串级联组装构建通用型电化学生物传感器超灵敏检测靶

权利要求书

1.基于构建一种稳定坚固的四面体三脚架辅助于多发夹串级联组装杂交反应超灵敏的电化学生物传感器优于检测核酸DNA和甲基化DNA，其方法技术都将进行在后详细说明。

2.根据权利要求1所述“四面体三脚架”3条55碱基链和82碱基长链通过高温变性稳定形成，3条链5’端修饰巯基，合成后TECP还原于电极上稳定修饰。

3.根据权利要求1所述多发夹串级联组装的均匀溶液各单独发夹通过高温变性后置室温过夜稳定形成，序列有效设计为靶标存在时促发逐个发夹后形成多发夹级联杂交链。

4.根据权利要求2所述四面体三脚架凸出顶端部分稳定识别捕获靶标，权利要求2所述发夹H1第一结构域在靶标存在时被催化打开，两者稳定杂交后顺利促发多发夹串级联杂交反应。

5.同时靶标和四面体凸出端含5’-CCGG-3’结合后在Hpa Ⅱ酶识别验证DNA甲基化,靶标:5’-TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACCGCAGGCCGG AGCTGCCGAGCTTT-3’；四面体三脚架:5’-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAAAGCTCGGCAGCTCCGGCCTGCG-3’。

6.根据权利要求3所述4发夹杂交链串联组装，各发夹各部分的碱基互补配对部分层层级联反应形成树枝状杂交链，稳定于四面体支架，发夹H1:5’-GTAGAGATGCGGTGGTCCTTGAGAGAATTCTTAACGTCGCCTCATACTGTCTCAAGGACCACCGCAT-3’；

发夹H2:5’-TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATGCGGTGGTCCTTGAGACAGTATGCCTAGCAGAGTT-3’；

发夹H3:5’-TCGCCTCCTAGCAGAGTTACTTTGAAACTCTGCTAGGAGGCGACGTTAAGAATTC-3’；

发夹H4:5’-TCAAAGTAACTCTGCTAGGAGGCGAGAATTCTTAACGTCGCCTCCTAGCAGAGTT-3’。

7.根据权利要求5，因RuHex的电活性，超灵敏吸附于负载面积很大的多分支串级联杂交链上，稳定2分钟，无光照下检测DPV响应信号。

8.根据权利要求1所述电化学生物传感器制备方法，技术如下：

(1)四面体四条S链在含30mM TCEP巯基还原剂的TM反应缓冲液中放置1小时充分还原，后95℃ 5分钟一步合成1μM四面体三脚架稳定存在并于-4℃储存待用，总体积100μL；

(2)在0.5 M H₂SO₄中活化电极直到15个可重复CV后进行下述实验，扫描电压设置范围为-0.2V-1.6V；

(3)发夹干粉溶解后需各自95℃ 5分钟后室温过夜形成终浓度1μM发夹结构，稀释于杂交链缓冲液（SPSC）中，并混合储存在-4℃，没有靶DNA存在和相应温度条件时无法促发杂交链反应,SPSC缓冲液包含1 M NaCl 和50 mM NaH₂PO₄；

(4)0.05μm氧化铝粉末少量超纯水中溶解混匀后抛光布上打磨金电极5分钟，分别超纯水、乙醇、超纯水超声仪中超声5分钟，食人鱼溶液以3:1的98% H₂SO₄和30% H₂O₂ 活化电极15分钟后可备用；

(5)10μL四面体0.5μM滴加电极上室温修饰过夜反；

(6)6μL 1mM MCH 滴加4℃封闭电极半小时；

(7)10μL靶DNA在DNA结合缓冲液中稀释（血清实验在10%血清中）滴加后37℃反应2小时，事先制备好的1μM发夹混合物滴加37℃反应5小时，DNA结合缓冲包括0.1M PB, 1 MNaCl 和20mM MgCl₂•6H₂O，PB 缓冲液包括0.2 M Na₂HPO₄和0.2 M NaH₂PO₄；

滴加10μL靶甲基化DNA 2h反应后加10μL一定酶活的HpaⅡ酶切37℃反应2h，后多发夹串级联组装反应；

在含有5mM(Fe(CN)₆)^3−/4−的0.1MKCl溶液中进行循环伏安(CV)和电化学阻抗谱(EIS)的表征；

(10)在相应浓度RuHex的10 mM Tri-HCl工作液中检测DPV，先稳定2分钟后开始检测，无明灯条件下检测。