[发明专利]基于四面体三脚架辅助的多发夹串级联组装构建通用型电化学生物传感器超灵敏检测靶

说明书

核酸是人体重要的遗传物质，在存储，复制和传递遗传信息中发挥重要作用，甲基化DNA是主要表观遗传学修饰方式之一，异常的DNA序列，碱基突变和表观遗传学变化常导致癌症的发生，为实现早期靶标检测，我们设计一个四面体辅助多串联发夹级联组装检测靶标（DNA/RNA/甲基化DNA等）的通用电化学传感器，孵育多个发夹级联组装触发信号扩增反应，电信号检测在RuHex溶液中实现，其强有力的静电吸引作用到DNA磷酸骨架上导致DPV电流响应增加。靶标检测线性浓度范围为10 aM至100 pM，最低检测限到1.78 aM。借助特异性酶切反应，在电化学平台上孵育甲基化DNA进行相关实验进一步证明该平台的优越性。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，构建多个发夹逐渐串联组装在DNA四面体三脚架的电化学生物传感器检测核酸 DNA和DNA甲基化。

背景技术

核酸作为人体的主要遗传物质，决定着生物分子，蛋白质和细胞成分的结构，并且在体内存储，调节和传递遗 传信息方面起着至关重要的作用。核酸的结构异常，基因碱基突变和染色体异常大大增加了癌症和疾病等的发 生率。DNA甲基化是主要的表观遗传学修饰方式之一，甲基基团在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化作用下与5- 甲基胞嘧啶通过共价键结合，甲基化常发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点(CpG岛)，表观遗传变化对于癌症的 早期诊断，预后和治疗起着至关重要的作用，有效的早期诊断将高度避免癌症和其他恶性肿瘤的发生，因此， 为了满足不断发展科学研究和临床需求，越来越多的超灵敏和超精确的DNA分子检测方法已在各个领域显得迫 在眉睫。

传统的核酸检测方法包括PCR，Southern Blot，基因分型，高分辨率熔解等，这些方法虽具有较高的优势， 却很容易造成假阳性信号的产生，且繁琐的实验程序和复杂的反应体系导致稳定性差，极大地阻碍了其更广泛 的临床应用。而光电化学生物传感器，荧光生物传感器，表面增强拉曼散射(SERS)，比色法也适用于检测DNA。 然而，经过许多参考文献的查阅学习和对相应靶标的详细探索和验证，具有更灵敏的检测，更简单的操作和更 低成本的电化学生物传感器被广泛应用于临床和其他研究领域中重要DNA分子标记物的检测，例如基于靶标诱 导的杂交链反应，分子标记反应，滚环扩增反应，链置换扩增反应等的靶标信号扩增反应技术等都是检测相应 靶标的有效方法。

利用电化学方法的优势，基于四面体三脚架的电化学生物传感器应运而生，借助一步等温多发夹串级联组装策 略快速检测目标DNA。四面体三脚架具有坚固的空间结构，极高的稳定性，可有效地提高目标DNA的捕获效率。 杂交链反应最早是由Dirks和Pierce于2004年提出的，杂交链反应将基于碱基互补配对的原理来产生长串联 DNA双链，并已广泛用于核酸检测的信号放大领域。

发明内容

基于之前单纯的双发夹组装仅通过简单的信号放大反应，在电极上孵育的四个发夹产生的串级联杂交联链，从 而增加了DPV信号物质的负载能力并增强DPV检测信号，实验操作非常简单，DPV信号物三氯化六铵合钌RuHex 在溶液中自由扩散，稳定存在使得检测结果稳定可重复。RuHex可以引起DNA磷酸骨架快速而有力的静态吸附， 从而导致电流增加，相应的电化学信号反映了在电极表面吸收的DNA分子的数量。在实验中用HpaⅡ甲基化限制性核酸内切酶验证甲基化DNA的检测。甲基化的DNA最常出现在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点(CpG)，因此拟议 的策略旨在捕获甲基化位点为5'-CCGG-3'的甲基化DNA，以更好地验证通用电化学生物传感器的优越性，体现 靶标临床应用检测的意义。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先发明涉及到的四面体三脚架为4条已设计好的互补碱基配对序列包括1条82碱基的长链和3条55个碱基 序列，并通过巯基稳定修饰在电极上。5’端到3’端序列依次是

四面体-S1:ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAAAGCTCGGCAGCTCCGGCCTGCG