[发明专利]基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法

权利要求书

1.基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、细胞系和试剂：首先获取mcf-7和T47D乳腺癌细胞株，在37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的rpi-1640中培养；

S2、逆转录-定量聚合酶链反应：用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA，然后用反转录试剂盒(Takara,Dalian,China)将提取的RNA反向转化为cDNA，Real-timePCR采用SYBRGreen(Takara)进行；

S3、微阵列分析：将MCF7细胞分为两组，一组给予50ug/ml叶黄素处理，另一组不作为对照组处理，24小时后，提取细胞总RNA，反转化为cDNA(initro)，然后用单色DNA标记试剂盒(Nimblegen)和杂交系统(Nimblegen)对DNA进行标记，然后进行图像采集和数据分析；

S4、细胞转染：特异性的CASC9siRNAs和siRNA(si-NC)、miR-590-3pmimic及其阴性对照(NC)mimic，细胞密度达到70％～80％后，利用lipofectamine3000(ThermoFisherScientific)将si-CASC9(si-NC)和miR-590-3pmimic(NCmimic)转染细胞；

S5、生物信息学分析：为了研究CASC9如何调控miR-590-3p，使用生物信息学网站进行分析；

S6、荧光素酶报告实验：将含有预测miR-590-3p结合位点的CASC9片段分别通过PCR扩增，克隆到pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体(PromegaCooperation)中，构建野生型CASC9报告载体(CASC9野生型；CASC9-Wt)；

S7、MTT试验：转染后，以5×104cells/mL(每孔100mol/L)的密度接种于96孔微板中，加入200ulDMEM培养过夜，然后将细胞加入不同剂量的叶黄素中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24、48、72小时后，每孔加入20个MTT(5g/l)和200个MTT，孵育细胞；4-6h后，在570nm处用酶标仪测定OD吸光度；

S8、统计分析：将数据进行统计分析。

2.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，mcf-7和T47D乳腺癌细胞株从美国型培养标本(ATCC,Manassas,VA,USA)中获得，在37℃、5％CO2、含10％胎牛血清(FBS)的rpi-1640中培养。

3.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，其特征在于，所述步骤S6中，构建野生型CASC9报告载体(CASC9野生型；CASC9-Wt)后，为了突变推测的miR-590-3p在CASC9中的结合位点，改变并替换该推测结合位点的序列，形成CASC9突变型(CASC9-mut)，最后，使用Lipofectamine^TM3000将mirna(miR-590-3p模拟物或miR-NC)和重组质粒共转染到HEK293T细胞中，48小时后，使用双荧光素酶报告基因检测系统(PromegaCorporation)检测荧光素酶活性。

4.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，其特征在于，所述步骤S7中，转染后，以5×104cells/mL的密度接种于96孔微板中，其中每孔为100mol/L，加入200ulDMEM培养过夜。

5.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，其特征在于，所述步骤S8中，数据分析采用SPSS22.0统计软件，数据以均数±标准差(X±SD)表示。

6.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，其特征在于，所述步骤S8中，多组间数据差异采用单因素方差分析，两组间比较采用学生t检验，p值为0.05被认为是显著的。