[发明专利]基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法在审

专利信息
申请号: 202011349263.5 申请日: 2020-11-26
公开(公告)号: CN112322740A 公开(公告)日: 2021-02-05
发明(设计)人: 常景芝;张玉霞;王琛;陈剑;芦琨;郭辉;郭亚丽;叶鑫;朱建设;刘青 申请(专利权)人: 商丘医学高等专科学校
主分类号: C12Q1/6886 分类号: C12Q1/6886;C12N15/113
代理公司: 北京国坤专利代理事务所(普通合伙) 11491 代理人: 王峰刚
地址: 476100 河南省商*** 国省代码: 河南;41
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摘要:
搜索关键词: 基于 incrna mirna 叶黄素 检测 方法
【权利要求书】:

1.基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1、细胞系和试剂:首先获取mcf-7和T47D乳腺癌细胞株,在37℃、5%CO2、含10%胎牛血清的rpi-1640中培养;

S2、逆转录-定量聚合酶链反应:用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA,然后用反转录试剂盒(Takara,Dalian,China)将提取的RNA反向转化为cDNA,Real-timePCR采用SYBRGreen(Takara)进行;

S3、微阵列分析:将MCF7细胞分为两组,一组给予50ug/ml叶黄素处理,另一组不作为对照组处理,24小时后,提取细胞总RNA,反转化为cDNA(initro),然后用单色DNA标记试剂盒(Nimblegen)和杂交系统(Nimblegen)对DNA进行标记,然后进行图像采集和数据分析;

S4、细胞转染:特异性的CASC9siRNAs和siRNA(si-NC)、miR-590-3pmimic及其阴性对照(NC)mimic,细胞密度达到70%~80%后,利用lipofectamine3000(ThermoFisherScientific)将si-CASC9(si-NC)和miR-590-3pmimic(NCmimic)转染细胞;

S5、生物信息学分析:为了研究CASC9如何调控miR-590-3p,使用生物信息学网站进行分析;

S6、荧光素酶报告实验:将含有预测miR-590-3p结合位点的CASC9片段分别通过PCR扩增,克隆到pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体(PromegaCooperation)中,构建野生型CASC9报告载体(CASC9野生型;CASC9-Wt);

S7、MTT试验:转染后,以5×104cells/mL(每孔100mol/L)的密度接种于96孔微板中,加入200ulDMEM培养过夜,然后将细胞加入不同剂量的叶黄素中,在37℃、5%CO2培养箱中培养24、48、72小时后,每孔加入20个MTT(5g/l)和200个MTT,孵育细胞;4-6h后,在570nm处用酶标仪测定OD吸光度;

S8、统计分析:将数据进行统计分析。

2.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法,其特征在于,所述步骤S1中,mcf-7和T47D乳腺癌细胞株从美国型培养标本(ATCC,Manassas,VA,USA)中获得,在37℃、5%CO2、含10%胎牛血清(FBS)的rpi-1640中培养。

3.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法,其特征在于,所述步骤S6中,构建野生型CASC9报告载体(CASC9野生型;CASC9-Wt)后,为了突变推测的miR-590-3p在CASC9中的结合位点,改变并替换该推测结合位点的序列,形成CASC9突变型(CASC9-mut),最后,使用LipofectamineTM3000将mirna(miR-590-3p模拟物或miR-NC)和重组质粒共转染到HEK293T细胞中,48小时后,使用双荧光素酶报告基因检测系统(PromegaCorporation)检测荧光素酶活性。

4.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法,其特征在于,所述步骤S7中,转染后,以5×104cells/mL的密度接种于96孔微板中,其中每孔为100mol/L,加入200ulDMEM培养过夜。

5.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法,其特征在于,所述步骤S8中,数据分析采用SPSS22.0统计软件,数据以均数±标准差(X±SD)表示。

6.根据权利要求1所述的基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法,其特征在于,所述步骤S8中,多组间数据差异采用单因素方差分析,两组间比较采用学生t检验,p值为0.05被认为是显著的。

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