[发明专利]基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法

说明书

本发明公开了基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，采用LncRNA芯片杂交检测叶黄素处理的MCF‑7细胞中受影响的候选LncRNA，real‑time荧光定量PCR检测叶黄素处理的MCF‑7和T47D细胞中CASC9和miR‑590‑3p的表达，利用生物信息学分析预测CASC9的潜在靶点，并通过双荧光素酶报告基因检测来证实CASC9和miR‑590‑3p之间的关系。采用MTT法测定乳腺癌细胞存活率。本发明从IncRNA和miRNA的角度探索叶黄素抗癌作用的新的分子机制，为叶黄素治疗乳腺癌提供药理依据，本发明表明CASC9/miR‑590‑3p轴参与了黄体素介导的乳腺癌抑制作用，具有较好的研究推广价值，利于对乳腺癌抑制有着重大积极作用。

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，具体为基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法。

背景技术

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一，1自20世纪90年代以来，我国乳腺癌发病率逐年上升，每年新增乳腺癌病例近120万，2、3一般认为乳腺癌的发生、发展和转移是基因、环境、生活习惯等一系列因素的结果，但乳腺癌的发病机制尚不清楚，仍缺乏有效的干预和阻断手段。

近年来，中医药在肿瘤的预防和治疗方面显示出巨大的潜力，叶黄素是一种从植物中提取的叶绿素含量较高的胡萝卜素，具有提高免疫细胞活性、预防动脉粥样硬化和老年性黄斑变性(AMD)、抗肿瘤等生物学功能，4-8我们先前的研究表明,叶黄素可以抑制乳腺癌细胞增殖的灭活NF-κB通路通过Nrf2/信号通路，9但叶黄素在预防乳腺癌中的作用机制有待进一步研究，非编码RNA是一类不具有编码蛋白质功能的RNA分子。10最近的研究表明，非编码rna如lncRNA和miRNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，11-13LncRNA和miRNA可以通过调节细胞增殖、迁移、凋亡和自噬等生理过程来影响肿瘤的发展，14-18作为新的生物标志物分子，具有良好的临床应用前景，但IncRNA和miRNA是否介导叶黄素在乳腺癌中的抗癌作用尚未见报道，本研究拟从IncRNA和miRNA的角度探索叶黄素抗癌作用的新的分子机制，为叶黄素治疗乳腺癌提供药理依据。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，包括以下步骤：

S1、细胞系和试剂：首先获取mcf-7和T47D乳腺癌细胞株，在37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的rpi-1640中培养；

S2、逆转录-定量聚合酶链反应：用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA，然后用反转录试剂盒(Takara,Dalian,China)将提取的RNA反向转化为cDNA，Real-timePCR采用SYBRGreen(Takara)进行，数据规范化GAPDH/U6,紧随其后的是量化的2-ΔΔCt方法；

S3、微阵列分析：将MCF7细胞分为两组，一组给予50ug/ml叶黄素处理，另一组不作为对照组处理，24小时后，提取细胞总RNA，反转化为cDNA(initro)，然后用单色DNA标记试剂盒(Nimblegen)和杂交系统(Nimblegen)对DNA进行标记，然后进行图像采集和数据分析；

S4、细胞转染：特异性的CASC9siRNAs和siRNA(si-NC)、miR-590-3pmimic及其阴性对照(NC)mimic购自GenePharma(上海，中国)，细胞密度达到70％～80％后，利用lipofectamine3000(ThermoFisherScientific)将si-CASC9(si-NC)和miR-590-3pmimic(NCmimic)转染细胞；

S5、生物信息学分析：为了研究CASC9如何调控miR-590-3p，使用生物信息学网站进行分析；