[发明专利]基于压力变性和蛋白质组定量的药物靶蛋白鉴定方法

说明书

本发明涉及一种基于压力变性和蛋白质组定量的药物靶蛋白鉴定方法。将药物和蛋白质样品孵育一段时间使药物和其靶蛋白结合后，对蛋白质样品施加压力，使样品中的蛋白质部分变性而沉淀。对施加压力后的蛋白质样品进行离心，除去由于压力而变性的部分不溶性蛋白质得到样品1。同时使用相同的条件对不添加药物的蛋白质样品进行处理得到样品2。对样品1和样品2使用液相色谱‑质谱联用技术，进行蛋白质的无标记或者标记定量。发现与药物孵育前后，在压力下浓度发生显著变化的蛋白质，即鉴定得到药物的靶蛋白。本发明通过压力变性和蛋白质组定量技术进行药物靶蛋白的鉴定，具有方法简单、重复性好、可实现药物靶蛋白的规模化鉴定(通量高)的优点。

技术领域

本发明涉及基于压力变性和蛋白质组定量的药物靶蛋白鉴定方法，具体地说是一种通过对与药物孵育及未与药物孵育的蛋白质样品施加压力，使其部分变性，然后通过对与药物孵育及未与药物孵育的蛋白质样品中各种蛋白质的浓度进行相对定量以鉴定药物靶蛋白的方法。

背景技术

蛋白质是重要的生物大分子，在生命活动中发挥着重要作用。现代药物的靶标大多数是蛋白质。同时，近年来的研究表明，大多数药物的靶标不限于单一的蛋白质。因此需要在蛋白质组水平对药物的靶蛋白进行规模化鉴定。药物靶标的鉴定不仅可以阐明药物的作用机理，还可以发现药物的脱靶效应和耐药性机制，发现治疗药物的新靶点；并在药物发现的早期阶段预测潜在的副作用和毒性，从而降低研发失败的风险。

随着质谱技术的发展，亲和色谱纯化结合液相色谱-质谱联用分析的蛋白质组学被广泛应用于药物靶标的鉴定。经过化学修饰的药物分子生物素化，与细胞裂解液孵育后用链霉亲和素磁珠富集特异性结合的蛋白质，或者先固定在亲和基质(琼脂糖、葡聚糖凝胶或者磁性颗粒)表面[Wei Y,Wang T,Liu C,et al.Chinese J Chem,2013,31(6):715；Shimizu N,Sugimoto K,Tang J,et al.Nat Biotech.2000,18(8):877]，再从细胞裂解液(或组织匀浆)中富集纯化药物靶标，然后用定量蛋白质技术鉴定蛋白质组[Bantscheff M,Eberhard D,Abraham Y,et al.Nat Biotech,2007,25(9):1035；Mulder C,Leijten N,Lemeer S,Curr Opin System Biol,2018,10:9]。该方法通过亲和纯化能够极大地简化质谱数据的复杂程度。但是这一策略的缺点是需要对小分子药物进行化学修饰以便引入官能团(连接臂)，而化学修饰过程不仅耗时费力，还可能会影响小分子药物与蛋白质的结合，而且有些小分子药物无法进行化学修饰。

为此，我们对共同孵育的药物和复杂蛋白质样品施加压力，使样品中的蛋白质部分变性而沉淀,并使用相同的压力条件对未与药物孵育的复杂蛋白质样品进行处理。然后使用定量蛋白质组学对上述两个样品中的蛋白质进行相对定量,实现对药物靶蛋白的鉴定和发现。

发明内容

药物的靶标大多数是蛋白质，并且大多数药物的靶标不限于单一的蛋白质，因此需要在蛋白质组水平对药物的靶蛋白进行规模化鉴定。传统的方法需要对小分子药物进行化学修饰，不仅耗时费力，还可能会影响小分子药物与蛋白质的结合。利用药物与其靶蛋白结合后可改变靶蛋白稳定性的特点，本发明利用外加压力对与药物孵育及未与药物孵育的蛋白质组样品进行处理，通过比较两个样品经过压力处理后各种蛋白质的相对含量，实现对药物靶蛋白的规模化鉴定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：