[发明专利]基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置

权利要求书

1.一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将激光器发出的激光光束准直后利用起偏器转为线偏光，这一线偏光包含S分量和P分量；

(2)调节液晶空间光调制器的出射平面与显微物镜入瞳共轭；使用液晶空间光调制器的一半部分，利用0-2π涡旋相位调制，调制步骤(1)线偏光中平行于调制偏振方向的偏振分量，而对垂直于调整偏振方向的偏振分量不做调制；

(3)液晶空间光调制器的出射光经四分之一波片后到达反射镜，通过反射镜反射回同一四分之一波片，之后到达液晶空间光调制器的另半部分；

(4)将液晶空间光调制器的另半部分加载为闪耀光栅，从而使线偏光未被调制的分量被调制而倾斜，根据光栅方程，通过调整光栅常数计算倾角，使得最终实心光斑和空心光斑在物面上错开；

(5)将空间光调制器的另半部分出射的两路光转为圆偏光；

(6)两路圆偏光在样品面上呈现错开的实心光斑和空心光斑，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，激发的两路荧光信号分别经过各自的探测光路，由两个探测器接收，从而获得共聚焦光强度分布和负共聚焦光强度分布；

(7)将负共聚焦光强度分布移位后与共聚焦光强度分布对应，根据荧光辐射差分公式，得到超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(1)中，光束通过起偏器后通过一个二分之一波片调整偏振方向；偏振方向应当通过负共聚焦光强度与共聚焦光强度之比来确定，即通过调整偏振方向使此二者强度匹配。

3.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(2)中，线偏光入射液晶空间光调制器前使用一个D形镜转折光路，以减小入射角，改善液晶空间光调制器的性能。

4.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液晶空间光调制器对线偏光一个分量的调制不限于将其调制为涡旋光以形成横向空心光斑，也可通过0/π环形相位调制在物面形成纵向空心光斑，这类纵向空心光斑在横向同样具有较弱的空心光斑效果，从而可以实现三维荧光辐射差分超分辨显微成像，其横向分辨率相对弱于横向空心光斑超分辨显微成像的横向分辨率，但纵向分辨率可极大提高，从而能够获得更多样品的细节信息。

5.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(6)中，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，通过两个针孔滤除离焦杂散光后，分别利用两个探测器获得实心光斑和空心光斑激发的荧光信号。

6.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(6)中，光斑错位并行扫描是通过液晶空间光调制器加载闪耀光栅的方式获得的，能够降低光路校准难度，且可以对光斑进行泽尼克像差矫正，获得最优光斑。

7.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(6)中，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，可以安装四个并排相邻的多模光纤，使用两端的光纤端面接收荧光信号，并用光电倍增管或雪崩光电二极管探测；而中间两光纤不接探测器，用于更方便的确定两荧光信号的间隔。

8.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(7)中，荧光辐射差分公式如下：

I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x+Δx,y+Δy)

其中I₁(x,y)为共聚焦光强度分布，I₂(x+Δx,y+Δy)为移位后的负共聚焦光强度分布，γ为差值系数。

9.一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像装置，其特征在于，该装置包括：

用于产生激发光的激光器及准直器；

用于产生线偏光的起偏器；

用于调整偏振方向的第一二分之一波片；

用于使用各半部分分别将线偏光的两个分量调制为涡旋光和倾斜光的液晶空间光调制器；

用于使线偏光的一个分量偏振方向旋转90度的第一四分之一波片及透镜和反射镜；

用于将两激发光转为圆偏光的第二四分之一波片和第二二分之一波片；

用于反射激发光而透射荧光的分光镜；

用于扫描样品的扫描振镜及显微镜架模块；

用于消除杂散光的滤光片；

用于消除离焦杂散光的针孔或多模光纤；

用于分别探测实心光斑和空心光斑的两探测器；

装置工作时，激光器及准直器产生的激光经过起偏器后成为线偏光，再由D形镜反射后到达液晶空间光调制器的下半部分；利用液晶空间光调制器仅可调制一个方向偏振光的性质，线偏光的P分量在此处被调制为涡旋光，而S分量未被调制；液晶空间光调制器的出射光经第一四分之一波片后到达反射镜，通过反射镜反射回第一四分之一波片，之后到达液晶空间光调制器的上半部分；利用反射镜使得入射光两次经过第一四分之一波片返回至液晶空间光调制器的上半部分，此时入射光相当于经过一个二分之一波片，从而使得原S分量得以在液晶空间光调制器的上半部分被调制而倾斜，将光分为两路；两路光分别入射至第二二分之一波片和第二四分之一波片成为圆偏光，通过用于中继共轭的4f系统、分光镜、扫描振镜及显微镜架模块并行扫描样品后，反向到达分光镜，此时激发光被反射而荧光信号通过分光镜后经滤光片及透镜后导入两多模光纤中，此处多模光纤的端面起到了普通共聚焦显微镜中针孔的作用，两光纤端面的间距和光斑间距相对应；最终荧光信号被两探测器探测，再经后续算法处理实现超分辨成像。