[发明专利]基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置

说明书

本发明公开了一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置，本方法利用液晶空间光调制器对荧光辐射差分超分辨显微成像中的激发光进行调制，将空间光调制器两部分分别加载为0‑2π涡旋相位调制和闪耀光栅，使得共路的激发光在样品面同时形成有一定距离的一个实心光斑和一个空心光斑，进行并行扫描，从而保证成像速度相较普通荧光辐射差分超分辨显微成像提高一倍的同时两激发光因共路而不易受到噪声、漂移等干扰的影响。

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

在生物学、生命科学等领域中，光学显微镜是观察细胞、细胞器、病毒等的重要手段。然而，由于衍射及成像系统孔径的存在，光学显微镜的分辨率存在限制，这一限制称为阿贝衍射极限，值为0.61λ/NA，其中λ是光波波长，NA是物镜的数值孔径。

为突破衍射极限，科研人员提出了多种超分辨显微技术，其中荧光辐射差分超分辨显微技术(Fluorescence emission difference microscopy,FED)具有较低的光漂白特性和较快的成像速度。FED显微系统包括两路不同模式的激发光，其一是共聚焦光，在焦面表现为实心光斑；另一路是负共聚焦光，表现为面包圈型的空心光斑，内部尺寸小于衍射极限。FED显微图像是由这两幅图像差分得到的。

考虑到FED需要两幅图像，为了进一步提高成像速度，并行荧光辐射差分超分辨显微技术(Parallel fluorescence emission difference microscopy,pFED)使用光束偏转装置在物面上将实心光斑和空心光斑错开一定距离，从而用二者同时对样品进行扫描和探测。然而，pFED中的两激发光路容易分别受到漂移、噪声等外界干扰，从而限制了其成像质量。

发明内容

本发明提供了一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置，本发明与pFED方法相比，激发光共路而非经过不同的器件，可以更好的消除漂移、噪声等外界干扰的影响。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明一方面提供了一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，该方法包括以下步骤：

(1)将激光器发出的激光光束准直后利用起偏器转为线偏光，这一线偏光包含S分量和P分量；

(2)调节液晶空间光调制器的出射平面与显微物镜入瞳共轭；使用液晶空间光调制器的一半部分，利用0-2π涡旋相位调制，调制步骤1)线偏光中平行于调制偏振方向的偏振分量，而对垂直于调整偏振方向的偏振分量不做调制；

(3)液晶空间光调制器的出射光经四分之一波片后到达反射镜，通过反射镜反射回同一四分之一波片，之后到达液晶空间光调制器的另半部分；

(4)将液晶空间光调制器的另半部分加载为闪耀光栅，从而使线偏光未被调制的分量被调制而倾斜，根据光栅方程，通过调整光栅常数计算倾角，使得最终实心光斑和空心光斑在物面上错开；

(5)将空间光调制器的另半部分出射的两路光转为圆偏光；

(6)两路圆偏光在样品面上呈现错开的实心光斑和空心光斑，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，激发的两路荧光信号分别经过各自的探测光路，由两个探测器接收，从而获得共聚焦光强度分布和负共聚焦光强度分布；

(7)将负共聚焦光强度分布移位后与共聚焦光强度分布对应，根据荧光辐射差分公式，得到超分辨图像。

进一步地，所述步骤(1)中，光束通过起偏器后通过一个二分之一波片调整偏振方向；偏振方向应当通过负共聚焦光强度与共聚焦光强度之比来确定，即通过调整偏振方向使此二者强度匹配。