[发明专利]一种快速检测巨细胞病毒中和抗体效价的方法

说明书

本发明提出了检测巨细胞病毒中和抗体效价的方法，该方法包括：将含有巨细胞病毒中和抗体的待检样品和巨细胞病毒人免疫球蛋白标准品分别与巨细胞病毒液混合，孵育；将孵育所得混合液接种成纤维细胞，培养；将培养所得细胞用细胞固定液固定，洗板，依次加入一抗溶液、二抗溶液或酶标二抗溶液和底物，得到待测液；将待测液进行图像采集，计数斑点，并基于斑点数确定待测样品中巨细胞病毒中和抗体效价；其中，巨细胞病毒液的滴度为1400～5600CCID₅₀/孔。本发明的检测方法可以简便、准确且快速地检测出巨细胞病毒中和抗体效价，重复性好，灵敏度高，客观性强，可以用于筛选出高质量HCMV IgG产品或血浆，应用价值高。

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及一种快速检测巨细胞病毒中和抗体效价的方法。

背景技术

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒科β属的DNA病毒，在正常人群中传播广泛，呈世界性分布，血清流行病学调查表明，40-100％成人有HCMV抗体。普通人通常为隐性感染，但对于免疫力低下人群，如骨髓和实体器官移植受者、HIV 感染者和肿瘤患者，HCMV感染会导致严重后果。孕妇原发或复发HCMV感染引起新生儿宫内感染或围产期感染侵袭胎儿，是导致人类先天畸形的重要原因之一。此外，HCMV 感染也是器官移植失败和艾滋病人并发感染死亡的主要原因之一。

鉴于HCMV对人类的巨大危害，人们一直在寻找更好的治疗方法。最常用的抗病毒药物为更昔洛韦，但是由于长期使用目前已经出现了很多耐药毒株，尤其是在移植患者和艾滋病患者中更为常见。具有高中和滴度的特异性HCMV IgG已被证明具有良好的治疗作用，而且不产生耐药性。因此，筛选含高HCMV中和滴度的血浆，制备静脉人免疫球蛋白制剂，将有助于对HCMV感染的治疗。

巨细胞病毒人免疫球蛋白(HCMV immunoglobulin，HCMV IgG)，来源于富含高效价HCMV IgG的健康人血浆，经特定分离纯化工艺制备而成。因其能特异性中和HCMV， 20世纪90年代，国外已有Cytogam和Cytotect两个上市产品用于预防器官移植术中的 HCMV感染，提高实体器官移植的成功率。目前国内HCMV IgG制品处于研发阶段，尚无相关产品上市销售，因此开发筛选高效价HCMV IgG原料血浆的方法用以制备高效价 HCMV IgG制品具有重要意义。

HCMV中和抗体效价高低是评价HCMV IgG产品有效性的关键指标之一，常用的免疫球蛋白ELISA检测方法。该方法原理为将纯化的病毒抗原吸附于固相上，通过孵育使稀释的特异性抗体与抗原结合，洗涤去除未与固相结合的抗体，加入用辣根过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白酶联物，孵育，去除未结合的酶联物，加入酶色原底物，产生的颜色与检测样本中的特异性抗体浓度成正比，该方法测量的结果以免疫球蛋白的含量为表征，其结果与测量的中和抗体效价有一定的差异，不是直观表征HCMV IgG产品有效性的指标。而目前直接检测HCMV中和抗体效价的方法有标准的噬斑减少中和试验(Plaque reductionnertralization test,PRNT)、微量细胞病变法等。

HCMV的复制周期非常长，最初的子代病毒释放发生在感染后48～72小时，由此中和抗体的测定需要使用10～14天的菌斑检测。中和抗体试验需要注意细节，以确保指示剂单层的存活。此外，准确读取HCMV斑块需要有鉴别HCMV成纤维细胞的经验，对实验人员的要求极高。因此寻找一种新型快速微量中和实验检测方法对于HCMV IgG产品的质量控制具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了检测巨细胞病毒中和抗体效价的方法和筛选HCMV IgG产品或血浆的方法，该检测方法可以简便、准确且快速地检测出巨细胞病毒中和抗体效价，重复性好，灵敏度高，客观性强，可以用于筛选出高质量HCMV IgG产品或血浆，应用价值高。