[发明专利]一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用有效
| 申请号： | 202011364791.8 | 申请日： | 2020-11-27 |
| 公开（公告）号： | CN112410276B | 公开（公告）日： | 2023-03-21 |
| 发明（设计）人： | 石利平;叶金星;陈本顺;何伟;徐春涛;程瑞华;孙伟振;仲召亮;张维冰;何义;尹斌;陆梦云 | 申请（专利权）人： | 江苏阿尔法药业股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/66;C12N9/04;C12P7/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 常州佰业腾飞专利代理事务所(普通合伙) 32231 | 代理人： | 马晓敏 |
| 地址： | 223800 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 苯基 还原酶 重组 菌株 构建 方法 应用 | ||
1.一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，其特征在于：所述重组菌株以pET-30a质粒为载体，表达2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因连接到pET-30a质粒的BamH I和XhoI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
2.根据权利要求1所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，其特征在于：所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建方法，其特征在于：设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1、P2，如SEQ IDNO：3-4所示；将pET-30a质粒BamH I和XhoI双酶切处理后，电泳检验回收；将目的基因与载体pET-30a连接，连接体系：目的基因4 μL，载体pET-30a 2 μL，Buffer 2 μL，连接酶1 μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入E. coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37 ℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的重组工程菌。
4.采用权利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株发酵生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶的方法。
5.根据权利要求4所述的生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶的方法，其特征在于：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株种子液按照2%的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6时，加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG，18 ℃诱导14 h，得到2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液。
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