[发明专利]一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，尤其是一种2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用，所述重组菌株以pET‑30a质粒为载体，表达2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶基因；所述2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明在大肠杆菌中实现了重组表达，手性选择ee值可达100％，可以替代现有的化学法进行(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的高效清洁生产。

技术领域

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，具体领域为一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建及其应用。

背景技术

替格瑞洛是一种由英国的阿斯利康公司所研发的新型的具有选择性的小分子抗凝血药，它是属于环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物，是一种选择性二磷酸腺苷受体拮抗剂，作用于P2Y12ADP受体来抑制ADP介导的血小板活化和聚集，该药于2011年7月被美国FDA批准上市，2012年11月获准在中国上市。其中，(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺是制备替格瑞洛的关键中间体。

目前文献报道的(1R，2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺的主要合成方法如下：

WO2008018822A公开了以邻二氟苯和氯乙酰氯为原料经傅克反应、不对称还原、环化、环丙烷化，氨解和霍夫曼降解得到(1R，2S)-2-(3,4_二氟苯基)环丙胺，其合成路线如下：

在上述合成路线中，化合物VII制备化合物VI采用化学方法进行不对称还原，存在手性选择性差、光学纯度差、操作繁琐、生产成本高且污染严重等问题。

CN107686447A和CN106906249A均提及了一种替格瑞洛中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的酶催化制备方法，但酶活较低，有机溶剂使用量大。且CN107686447的酶催化反应需要葡糖的添加，增加了废水处理量，且真菌发酵产酶的生产成本要高于常规的E.coli菌株。

因此，目前仍亟需一种经济有效的(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用，通过基因工程技术筛选高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原的还原酶基因并实现异源功能性表达，获得高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成重要的药物中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物催化剂。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，以pET-30a质粒为载体，表达2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因连接到pET-30a质粒的BamH I和XhoI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。

一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建方法：