[发明专利]一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法

权利要求书

1.一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1）将PE与第一交联剂反应；步骤2）将抗体与第二交联剂反应；步骤3）将步骤1）交联后的PE和与步骤2）交联后的抗体进行交联反应；

其中，所述第一交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic，所述的第二交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB；或

所述第一交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB，所述的第二交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，第二交联剂与抗体分子中的氨基结合；所述步骤1）中的PE上的氨基与第一交联剂反应。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过脱盐处理除去所述步骤1）和步骤2）中未参与反应的第一交联剂和第二交联剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3）中在反应混合物加入过量的第二交联剂，用来封闭过剩的与第一交联剂反应的PE，封闭后加入过量的半胱氨酸并用超滤管去除未反应的PE。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，在步骤1）交联后的PE和与步骤2）交联后的抗体中加入亲核催化剂进行交联反应；优选地，所述亲核催化剂为腙基催化剂；在一些实施例中，所述的腙基催化剂选自2, 4-二甲氧基苯胺、苯胺、苯胺衍生物，5-氨基吲哚，苯二胺衍生物, 3,5-二氨基苯甲酸, 邻氨基苯甲酸衍生物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）的具体方法为：向抗体中加入第二交联剂溶液，混匀后反应，在本步骤中，第二交联剂分子与抗体分子中的游离氨基结合，制备第二交联剂-抗体；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将抗体定容。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)的具体方法为：向PE中加入第一交联剂溶液，混匀后反应,在本步骤中，第一交联剂分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合，制备第一交联剂-PE；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将PE定容。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，取步骤2）获得的封闭后的抗体与步骤1）获得的封闭后的PE混匀反应即制备的抗体-PE，其中，所述抗体和PE的摩尔比为1：1~5，优选为1:3；加入第二封闭剂，对未反应的第一封闭剂-PE进行封闭反应后后加入半胱氨酸，封闭过量第二封闭剂，反应后将混合液通过超滤管进行超滤，去除未交联PE。

9.一种荧光蛋白探针的制备方法，其特征在于，该方法包括将PE与Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic反应；优选地，向PE中加入Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic溶液，混匀后反应,在本步骤中，Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-4FB或Sulfo-S-HyNic或-S-4FB或S-HyNic分子与藻红蛋白分子中的游离氨基结合；将获得的反应液移至超滤离心管内，再加入磷酸钠缓冲液，离心并除去滤液，再加入磷酸钠缓冲液混匀离心，重复此操作多次并将PE定容。

10.根据权利要求9方法制备获得的荧光蛋白探针。