[发明专利]一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法

说明书

本发明涉及一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法，该方法包括如下步骤：步骤1）将PE与第一交联剂反应；步骤2）将抗体与第二交联剂反应；步骤3）将步骤1）交联后的PE和与步骤2）交联后的抗体进行交联反应；其中，所述第一交联剂为Sulfo‑S‑HyNic或S‑HyNic，所述的第二交联剂为Sulfo‑S‑4FB或S‑4FB；或所述第一交联剂为Sulfo‑S‑4FB或S‑4FB，所述的第二交联剂为Sulfo‑S‑HyNic或S‑HyNic；该方法在进行免疫检测时，阳性信号强、信噪比高。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种藻红蛋白等免疫荧光蛋白标记的方法。

背景技术

藻红蛋白(P-phycoerythrin，简称PE)是从红藻中分离纯化获得的、目前普遍使用的一种新型荧光标记试剂。在特定波长激发下，藻胆蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的30-100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。

将藻红蛋白用于荧光分析，具有传统化学荧光染料无法比拟的优越性。比如：(1)在较宽的pH范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰；(2)吸光度和荧光量子产率很高，荧光强而稳定，灵敏度高；(3)具有较小的荧光背景，不易淬灭，荧光保存期较长；(4)水溶性极佳，易与其他分子交联结合，非特异性吸附少；(5)纯天然海洋生物提取，无任何毒副作用，不含放射性，操作使用非常安全。

现有技术中常常采用PE标记法，将藻红蛋白与抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等物质结合，制成荧光探针。通过检测其发出的荧光，可以用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、蛋白质和核酸等生物大分子的分析；还可以用于免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定等临床诊断及生物工程技术。

传统的PE标记法(如AnaTag^TM R-PE Labeling Kit)的实施步骤大致是：(1)将目标蛋白巯基化；(2) 采用SMCC对PE进行活化；(3)将巯基化后的目标蛋白与活化后的PE交联。

本发明开发的PE标记法(其他应该蛋白标记方法类似)的实施步骤大致是:(1)将PE与Sulfo-S-4FB 反应；(2)将抗体与Sulfo-S-HyNic反应；(3)将与Sulfo-S-4FB反应的PE和与Sulfo-S-HyNic反应的抗体进行交联反应。(也可以(1)将PE与Sulfo-S-HyNic反应；(2)将抗体与Sulfo-S-4FB反应；(3)将与 Sulfo-S-HyNic反应的PE和与Sulfo-S-4FB反应的抗体进行交联反应。)

由于目标蛋白和藻红蛋白上既携带氨基，又携带巯基，当采用传统的SMCC等胺-巯基交联剂进行活化时，胺-巯基交联剂不仅会与氨基结合，也会与巯基结合，这就导致当被胺-巯基交联剂活化的蛋白与巯基化蛋白交联时，被胺-巯基交联剂活化的蛋白上那些已与巯基结合的交联剂难以与巯基化蛋白再发生交联，导致目标蛋白上结合的藻红蛋白少、标记效果差，获得的免疫荧光探针产生的阳性信号弱、背景信号强，检测时信噪比低。正熙生物开发的方法实现了抗体和荧光蛋白的定向偶连，不存在抗体之间的复合物以及荧光蛋白之间的复合物。

发明内容

本发明提供一种提高抗体与荧光蛋白定向偶联标记信噪比的方法，该方法包括如下步骤：步骤1)将 PE与第一交联剂反应；步骤2)将抗体与第二交联剂反应；步骤3)将步骤1)交联后的PE和与步骤2) 交联后的抗体进行交联反应；

其中，所述第一交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic，所述的第二交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB；或所述第一交联剂为Sulfo-S-4FB或S-4FB，所述的第二交联剂为Sulfo-S-HyNic或S-HyNic；该方法在进行免疫检测时，阳性信号强、信噪比高。

在一些实施方式中，所述步骤2)中，第二交联剂与抗体分子中的游离氨基结合。