[发明专利]一种有效降低PKA含量的人血白蛋白的制备方法

说明书

本发明一种有效降低PKA含量的人血白蛋白的制备方法，在FIV分离过程中使用磷酸盐进行离子强度控制，提高白蛋白溶解度的同时降低PKA的溶解度，从而沉淀去除更多的PKA，制备得到低PKA含量的人血白蛋白；在产品制备的下游通过A50凝胶吸附和活性炭滤板吸附相结合除杂，A50凝胶主要对PKA等丝氨酸蛋白酶、结合珠蛋白和α酸性糖蛋白进行吸附，活性炭滤板主要对血红素、内毒素和丝氨酸蛋白酶等进行吸附，因此在产品制备的下游通过A50凝胶吸附和活性炭滤板吸附相结合，可有效降低PKA含量、改善制品外观和降低内毒素含量、降低多聚体含量、提高白蛋白纯度及产品安全性；对A50凝胶进行预处理，使得A50凝胶的吸附效果更佳。

技术领域

本发明涉及人血白蛋白的制备方法技术领域，具体涉及一种有效降低PKA含量的人血白蛋白的制备方法。

背景技术

自1940年代COHN低温乙醇工艺建立以来，人血白蛋白在临床上已安全使用了差不多80年。人血白蛋白广泛应用于失血性休克、低蛋白血症、肿瘤的治疗，是一种不可替代的治疗制剂。但是在人血白蛋白制剂中可能残留的PKA，在输注过程中将引起病人血压下降，导致严重的不良反应，因此药典规定人血白蛋白制剂PKA含量应不超过35IU/ml。

在人血白蛋白的生产制备过程中可能因多种原因导致凝血因子XII活化，活化的XIIa碎片或其改变形式即为PKA，能引起前激肽释放酶转化为激肽释放酶，激肽释放酶活化激肽原将其转化为缓激肽，缓激肽引起血管疏张，毛细血管通透性增加，导致血压降低。

在人血白蛋白的生产过程中PKA主要分布在FIV沉淀中，因此FIV分离参数是控制人血白蛋白PKA含量的关键参数，离子强度、反应温度、沉淀老化时间等参数影响PKA溶解度，从而影响其在沉淀和上清液中的分布，最终影响人血白蛋白产品中PKA的含量；助滤剂用量、滤板种类选择也影响深层过滤过程对PKA的吸附作用。

为了降低人血白蛋白制剂中PKA含量，有的工艺使用蛋白酶抑制剂如糜蛋白酶或C1酯酶抑制剂来灭活PKA，但是使用蛋白酶或蛋白酶抑制剂可能破坏凝血因子之间微妙平衡关系，导致一系列凝血因子的活化，为血浆蛋白的分离纯化带来困难；有的工艺使用气相二氧化硅吸附丝氨酸蛋白酶来去除PKA，但该方法存在引入重金属的风险；有的工艺通过在60℃10小时巴氏病毒灭活外额外增加58~65℃数小时加温灭活PKA，但是该方法延长白蛋白分子暴露于苛刻环境下的时间，可能存在引起蛋白质分子构象变化，有产生新抗原的风险。

在血浆中存在多种与人血白蛋白理化性质相似的血浆蛋白，如结合珠蛋白、血红素结合蛋白、转铁蛋白、β2-微球蛋白、α-酸性糖蛋白，这些蛋白质很难通过改变溶解度经沉淀的方法从白蛋白制剂中彻底去除，成为白蛋白制剂中的主要杂蛋白，在巴氏灭活过程或长期储存过程中可能与白蛋白分子共价结合，导致白蛋白多聚体和寡聚体含量增加，影响产品的长期稳定性、安全性和有效性，白蛋白寡聚体会降低其维持渗透压的作用，多聚体会很快被机体清除，缩短其半衰期，影响其血容扩张作用，白蛋白的运载功能也取决于其分子完整性，类固醇、脂肪酸、胆红素等与白蛋白寡聚体的亲和力比与单体的亲和力弱。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种工艺简单、产量高的有效降低PKA含量的人血白蛋白的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种有效降低PKA含量的人血白蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）调节FIV分离离子强度：在FI+II+III/FII+III上清液中添加0.8～1.2mol/L的磷酸盐缓冲液，将离子强度控制在0.08～0.12，得到调节了离子强度的上清液；

（2）调节FIV分离液pH：用醋酸盐缓冲液将所述的调节了离子强度的上清液的pH调节至5.8～6.2，得到调节了pH的上清液；