[发明专利]一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明提供了一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法，包括试剂R1和试剂R2；将抗鼠IgG‑Fc抗体与胶乳微球表面氨基反应形成shiff碱，使抗鼠IgG‑Fc抗体定向标记于胶乳微球上，再将抗鼠IgG‑Fc抗体与至少两种鼠抗人CK‑MB单克隆抗体连接，使胶乳微球偶联上鼠抗人CK‑MB单克隆抗体，制得胶乳微球试剂，然后将胶乳微球试剂加入封闭缓冲液重悬超声后进行封闭，再加入胶乳保存液重悬超声制得胶乳试剂，至少两种胶乳试剂混合制成试剂R2；与现有技术相比，本发明的试剂盒灵敏度高、检测范围宽、重复性好、特异性高、稳定性好；相较于其他偶联方法，本发明的方法避免了CK‑MB单克隆抗体F(ab)端活性位点偶联于微球上，同时增加了CK‑MB单克隆抗体偶联量，显著提高了试剂检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及医学、免疫和体外诊断领域，具体是一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肌酸激酶(CK)是心肌中重要的能力调节酶，主要催化高能磷酸键从ATP转移到肌酸，生成磷酸肌酸。磷酸激酶是二聚体酶，主要存在于心肌组织中，在骨骼肌中也有微量分布，其结构由肌型亚单位(M)和脑型亚单位(B)两个亚基组成，根据其亚基组成不同，可分为CK-MM、CK-BB、CK-MB和线粒体肌酸激酶等四种同工酶形式，其中CK-MM主要存在于骨骼肌中，CK-BB主要存在于脑组织中，CK-MB主要存在于心肌组织中。CK-MB分子量为80kD，由M和B两个亚单位(每个亚单位分子量为40kD)组成，在心肌组织中的占CK总量得20％左右，在骨骼肌中也有微量分布，血清中CK-MB含量对诊断急性心肌梗死、心肌炎等心肌缺血性疾病有重要意义。

CK-MB在心肌损伤早期即可出现于循环血中，于心肌损伤后2-6h开始升高，在12-24h内达到峰值，36-72h内降至正常水平，CK-MB含量和时间变化对心肌损伤发病时间，梗死体积以及再灌注后损伤有重要意义。此外，骨骼肌损伤，横纹肌溶解症及中风等疾病中也伴随有CK-MB升高。在心肌损伤相关疾病诊断上，常与肌红蛋白和肌钙蛋白I联合检测。

目前常规的CK-MB检测主要采用免疫抑制法，检测的是CK-MB的活性，其原理是应用单克隆抗体与肌酸激酶中的M亚基结合，抑制CK-MM及CK-MB中的M亚基的活性，再测定B亚基的活力，将结果乘以2即为CK-MB的活力，该方法忽略血清中微量的CK-BB，但对某些恶性肿瘤患者、脑神经损伤或平滑肌受损的患者，它们血清中的CK-BB含量会增高，或出现线粒体CK(CK-Mt)，由于其活性不受抗M抗体的抑制，其B亚基活性与CK-MB中B亚基活性同时被测，导致CK-MB检测异常增高，易引起AMI的误诊。

酶联免疫法(ELISA)是基于双抗体夹心法检测CK-MB，该方法特异性强，但操作繁琐，自动化程度低，耗时长。

胶体金免疫层析法，操作简便，快速，适合于急诊，但其灵敏度低，手工加样易受操作者影响，常会出现假阴性。

化学发光测定CK-MB质量是美国心脏病协会和欧洲心脏病协会推荐的检验方法，其原理是基于双抗体夹心法原理的化学发光免疫分析方法，将纯化的特异性鼠单克隆抗体预先包被在载体上，加入待测样本和酶标记的特异性单克隆抗体，形成特异性抗体-抗原-酶标记抗体的免疫复合物，经过激发后发出光子，根据激发光的大小得出样本中CK-MB的质量数。该化学发光测定特异性强，精密度高，但成本高，耗时长不适用于筛查工作和急诊。

胶乳増强免疫比独法是一种动态测定抗原抗体结合的检测方法，在特定的稀释系统中，抗原抗体发生结合，并且在结合比例合适时，微粒会从液相析出；在抗原和抗体结合的前后，会发生浊度的变化；通过全自动生化分析仪检测这种浊度变化，并利用标准品绘制线性曲线，可得出相应样品中待测物质的含量。CN111562372A公开了基于胶乳增强免疫比浊法的肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒，但其存在分析灵敏度达不到临床要求的问题。

发明内容