[发明专利]秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法

权利要求书

1.秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤S1：秦巴硒菇提取物对体外白血病细胞的实验研究

S101：测定秦巴硒菇提取物对白血病细胞的敏感性

S102：检测细胞凋亡率

S103：检测细胞周期

步骤S2：秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病动物的实验研究

S201：慢性髓系白血病动物模型的建立

选择4-5周龄，体重为18-20g的雄性NOD/SCID小鼠，于SPF环境中，温度为22±1℃，自由进食水喂养一周后，小鼠状态良好；取对数生长期的原代细胞，用0.9％的生理盐水将细胞密度调整至1×10⁶/mL，将细胞悬液通过尾静脉接种于NOD/SCID小鼠，接种体积为200μL，空白组小鼠尾静脉注射等量的0.9％的生理盐水，动态观察模型小鼠精神、食欲、体重、活动能力、腹水及生存时间；接种细胞悬液两周后，将发病小鼠随机分成实验组、空白对照组和阳性对照组，每组6只，实验组的小鼠尾静脉注射浓度梯度为50，75，100mg/kg的FA-2-b-β，空白对照组的小鼠尾静脉注射等量0.9％的生理盐水，阳性对照组的小鼠尾静脉注射等量5mg/kg的伊玛替尼；实验期间每天观察模型小鼠精神、体重、体毛改变及活跃情况，记录模型小鼠死亡时间并绘制生存曲线，设定实验观察终点为120天；

S202：模型小鼠外周血细胞数、体重检测；

步骤S3:RT-qPCR法检测K562、原代细胞，模型小鼠脾脏组织相关凋亡基因表达；

步骤S4:Western-blot法检测K562、原代细胞，模型小鼠脾脏组织相关凋亡蛋白表达；

步骤S5：模型小鼠HE、免疫荧光、免疫组化检测；

步骤S6：统计软件使用PRISM7，数据表示为X±SD，各组数据采用单因素方差分析，2组数据比较，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法，其特征在于，上述步骤S101的具体过程如下：

(1)骨髓单个细胞核提取；

(2)细胞复苏、冻存；

(3)CCK8法检测细胞增殖抑制率实验；

CCK8法评估K562细胞、原代细胞活力，收集生长对数期K562细胞、原代细胞重悬于RPMI-1640培养基中，分别将这两种细胞以密度为1×10³个细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔中100μL细胞悬液，37℃，5％的CO₂饱和湿度培养箱进行孵育，按浓度梯度分别加入0mg/mL、0.9mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2.1mg/mL的FA-2-b-β作用于生长对数期K562细胞、原代细胞，每孔加至150μL，每组设置5个复孔，分别培养24h、48h、72h，培养终止前加入10μLCCK8试剂；继续孵箱中培养1-2h，将96孔板置于漩涡振荡器上震荡5min，酶标仪检测450nm波长处吸光度值，计算FA-2-b-β对白血病细胞的增殖抑制率；增殖抑制率＝[1-(加药组A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)]×100％，计算药物的抑制率，实验重复3次，并根据直线回归法计算其半数抑制浓度IC₅₀值，其中，A值表示450nm波长处吸光度值。

3.根据权利要求2所述的秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法，其特征在于，骨髓单个细胞核提取过程为：

收集骨髓液按照1:1加入等体积的无菌PBS溶液进行稀释，充分混匀，在新的无菌15mL离心管中加入4mL Ficoll淋巴细胞分离液，用吸管将上述稀释后的骨髓液沿离心管管壁缓慢加入到Ficoll淋巴细胞分离液上层，使骨髓稀释液与Focll淋巴细胞分离液形成分界面；然后2000rpm离心15min，离心结束后取出离心管，可见液体分离4层，骨髓上清层-单个核细胞层-Ficoll分离液层-红细胞层；吸管小心吸取中间呈白色雾状的单个核细胞层，转移至15mL离心管中，在细胞悬液中加入无菌PBS洗涤后的细胞，1500rpm离心5min，弃掉上清，重悬细胞进行二次洗涤离心收集细胞沉淀，加入细胞冻存液放入细胞冻存管中，-80℃冰箱保存。