[发明专利]氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法

权利要求书

1.一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在大肠杆菌MG1655 (DE3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶A连接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黄素合成酶CURS3以及乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1；

编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶4CL的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，编码所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，编码所述姜黄素合成酶CURS3的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示，编码所述乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分别如 SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

合成路径规划成三个模块，模块Ⅰ包含4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl，模块Ⅰ在质粒pACYCDuet上，模块Ⅱ包含二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3，模块Ⅱ在质粒pRSFDuet上，模块Ⅲ包含乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1，模块Ⅲ在质粒pCDFDuet上。

2.一种如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）对所述关键酶的5条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成；

（2）通过酶切酶连方法构建4CL表达质粒：pACYC-4CL；

（3）通过酶切酶连方法构建DCS和CURS3表达质粒：pRSF-DCS-CURS3；

（4）通过酶切酶连方法构建AccBC和DtsR1表达质粒：pCDF-AccBC-DtsR1；

（5）步骤（2）、（3）、（4）中的表达质粒，电转化入MG1655 (DE3)感受态细胞中；

（6）对应重组质粒的抗性，对长出的菌落进行筛选，并进一步利用PCR验证重组菌株的正确性。

3. 一种利用如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，其特征在于，将所述大肠杆菌工程菌接种到含有100 mL LB培养基的500 mL平底三角摇瓶中，在37℃、220 rpm条件下培养至OD600 为 0.6时，加入终浓度0.5 mM的IPTG和0.5mM的对氨基肉桂酸，在25℃、220 rpm条件下继续培养36 h。

4. 一株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）HXJE109，保藏编号为CGMCC NO.20984。