[发明专利]氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法

说明书

本发明涉及氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法。本发明公开了一株以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌株，属于合成生物学或者代谢工程领域。本发明将4‑香豆酰辅酶A连接酶基因4cl、二聚酮合酶基因dcs、姜黄素合成酶基因curs3以及乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1组成合成途径转入大肠杆菌MG1655(DE3)中，并对合成途径进行模块划分及优化，得到了产量最优的一株工程菌。通过对发酵条件的优化，最终使得该菌株在以对氨基肉桂酸为底物发酵48h后，氨基双去甲氧基姜黄素的产量达到33mg/L。本发明为高活性氨基双去甲氧基姜黄素的工业化生产和应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于代谢工程领域，涉及一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；尤其涉及一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的高产菌株构建方法以及发酵条件优化。

背景技术

姜黄素类化合物是中药姜黄中具有药理作用的主要活性成分，根据其结构的不同，主要分为三种：姜黄素(curcumin，C₂₁H₂₀O₆)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin，C₂₀H₁₈O₅)以及双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin，C₁₉H₁₆O₄)。姜黄素类化合物具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及抗心脑血管活性，另一方面姜黄素在食品工业中也被广泛用作于食品添加色素。因此该类化合物具有广阔的应用前景。

根据前期课题组的研究，一种氨基双去甲氧基姜黄素(NH₂-bisdemethoxycurcumin，NBMC)具有更高于天然双去甲氧基姜黄素的抗炎能力。该化合物在此之前没有相关报道，因此不能使用天然的植物提取方法来获得。目前关于姜黄素类化合物的微生物发酵方法已逐渐成为该类化合物获取的主要研究对象，具有一定的研究基础。而氨基双去甲氧基姜黄素的获取，在一定程度上也为后续获得氨基姜黄素等其他衍生产物提供了可能。

本发明是以对氨基肉桂酸为底物，通过对合成途径进行模块划分及优化，使其获得较高的氨基双去甲氧基姜黄素的产量，并通过发酵条件的优化进一步提升了最终的产量，为后续的的大规模工业化生产提供了研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；本发明提供了一株高产氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，并通过发酵条件的优化进一步提高菌株的产量，为其工业化生产奠定了基础。

本发明的目的是通过以下技术手段实现的。

第一方面，本发明提供一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，在大肠杆菌MG1655(DE3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶A连接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黄素合成酶CURS3以及乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1。

编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述姜黄素合成酶CURS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

作为本发明的一个实施方案，通过同时使用3个载体对所述5条基因进行共表达。所述载体在以下4个拷贝数不同、抗性不同的载体中随机组合：pRSFDuet-1(拷贝数100，Kan)、pETDuet-1(拷贝数～40，Amp)、pCDFDuet-1(拷贝数20-40，Spe)和pACYCDuet(拷贝数10-12，Chl)。