[发明专利]非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究方法

权利要求书

1.非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究方法，其特征在于：通过对非小细胞肺癌培美曲塞A549/PEM耐药细胞株中的差异表达蛋白的研究来实现非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究。

2.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究方法，其特征在于，非小细胞肺癌培美曲塞A549/PEM耐药细胞株中的差异表达蛋白的研究具体包括以下步骤，

S1：非小细胞肺癌培美曲塞A549/PEM耐药细胞株的构建及鉴定；

S2：利用iTRAQ技术分析A549/PEM耐药细胞株中的差异表达蛋白；

S3：从步骤S2分析得到的差异表达蛋白中筛选出若干个兴趣蛋白进行PRM验证；

S4：对步骤S3中经过验证的兴趣蛋白进行分析，进一步的筛选出两个目标差异蛋白进行药物敏感性研究。

3.根据权利要求2所述的非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究方法，其特征在于，步骤S1的具体操作包括，

S11、细胞培养：将非小细胞肺癌的亲本细胞株A549培养在含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中孵育；

S12、NSCLC亲本细胞株A549的IC50值测定：

S13：采用高浓度反复间歇诱导法，构建PEM耐药NSCLC细胞株A549/PEM；

S14：A549/PEM耐药细胞株耐药指数的测定。

4.根据权利要求3所述的非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究方法，其特征在于，步骤S12的具体操作包括，

S121：取生长状态良好的A549对数生长期细胞，每孔按4×10³个接种至96孔板中，每组设置3个复孔，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养；

S122：待细胞贴壁后，在NSCLC亲本细胞株A549中分别加入1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml的PEM；

S123：继续培养48h后，弃培养基，每孔加入新鲜配制的含10μL的毒性检测液CCK8；将培养板在培养箱孵育1-4小时；

S124：用酶标仪测波长为450nm的吸光度，计算亲本株的半数抑制浓度IC50。

5.根据权利要求4所述的非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究方法，其特征在于，步骤S13的具体操作包括，

S131：选取终浓度为1/3亲本株半数抑制浓度IC50的培美曲塞，冲击对数生长期A549亲本株；

S132：药物作用24小时后，弃去含药培养液，换不含药的新鲜培养液；

S133：待细胞长至70％-80％时，重复原剂量冲击，如此反复冲击8代，最终成活的细胞株即为A549/PEM耐药细胞株。

6.根据权利要求5所述的非小细胞肺癌对培美曲塞耐药性的研究方法，其特征在于，步骤S14具体操作包括，

S141：取生长状态良好的A549/PEM耐药细胞株，每孔按4×10³个接种至96孔板中，每组设置3个复孔，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养；

S142：待细胞贴壁后，分别用浓度为4000ng/ml、2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml的PEM对A549/PEM耐药细胞株进行处理；

S143：继续培养48h后，弃培养基，每孔加入新鲜配制的含10μL的毒性检测液CCK8；将培养板在培养箱孵育1-4小时；

S144：用酶标仪测波长为450nm的吸光度，计算A549/PEM耐药细胞株的半数抑制浓度IC50；

S145：利用公式RI＝A549/PEM耐药细胞株的半数抑制浓度IC50/亲本株的半数抑制浓度IC50计算A549/PEM的耐药指数。