[发明专利]一种利用诱导多能干细胞构建妊娠期致流产药物筛查模型的方法及应用

说明书

本发明公开了一种利用诱导多能干细胞构建妊娠期致流产药物筛查模型的方法，通过三维悬浮培养的方式对诱导多能干细胞进行培养，形成拟胚体；向拟胚体的培养基中施加待筛选药物暴露，通过分析拟胚体在含有待筛选药物的培养基中的发育指标筛选和/或评价该药物。本发明还公开了上述方法在妊娠期致流产药物筛查中的应用，该方法构建的模型基于拟胚体类器官的发育，动态模拟了整体胚胎早期妊娠流产的过程，观察其发育形态学和胚层分化的改变，检测拟胚体直径大小变化、拟胚体内部细胞凋亡变化及拟胚体胚层的发育水平，以此为标准确定药物流产毒性评价的指标，为后续药物筛选提供参考。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及一种利用诱导多能干细胞构建妊娠期致流产药物筛查模型的方法及应用。

背景技术

随着我国“全面两孩”政策的开放，高龄和高危产妇增多，妊娠期用药往往不可避免。妊娠期药物的系统评价显示，60％～90％妊娠期妇女需要使用药物，平均用药2～4种，最多达8种。其中约79％孕妇服用过对胎儿影响不明的药物，增加了自发流产、早产和低体重儿的发生概率。因此，有效地筛查具有生殖毒性的药物，对实现妊娠期妇女安全用药这一目的至关重要。传统的药物生殖毒性风险评估往往是基于怀孕的实验动物模型或细胞模型筛选的结果。动物模型通常以小鼠、家兔和斑马鱼等作为实验动物。利用此模型筛选药物通常面临构建怀孕动物模型耗时费力、实验成本高昂等问题。动物与人类还存在种属差异性问题，其结果可能无法准确地预测药物在人体的不良反应。细胞模型是一种动物替代的实验方法，其中胚胎干细胞实验(Embryonic stem cell test,EST)被正式批准用于体外筛选生殖毒性药物和化合物。但是它丧失了组织、细胞发育的微环境，破坏了组织和器官的结构，不利于对整体胚胎发育的毒理学分析。因此，寻求一种简便、灵敏、准确、经济的妊娠期药物筛选模型势在必行。

通过干细胞重编程技术，利用诱导多能干细胞(Induced pluripotent stemcells,iPS细胞)对药物进行筛选逐步得到广大药物和医务工作者的认可。iPS细胞是通过特定基因转染或小分子化合物诱导等方式，使正常体细胞重编程为胚胎干细胞(embryonicstem cells,ES细胞)式的多潜能细胞。利用人类源性诱导多能干细胞建立发育毒性药物筛选存在以下优势：1.两者在细胞形态、生长特性、细胞标志物表达类似，具有体外发育成三胚层的潜力；2.iPS细胞取材方便，制备的来源细胞类型很多，如成纤维细胞、外周血细胞和脂肪干细胞等，规避了破坏胚胎等伦理学问题；3.人类来源的iPS细胞模型无物种差异性问题。目前利用诱导多能干细胞构建模型实现对药物的筛选已广泛应用于神经发育毒性和心血管发育毒性等研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种利用诱导多能干细胞构建妊娠期致流产药物筛查模型的方法，该方法可有效确定药物流产毒性评价指标，并对后续药物筛选具有参考价值。

本发明的目的之二在于提供该方法在妊娠期致流产药物筛查中的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种利用诱导多能干细胞构建妊娠期致流产药物筛查模型的方法，包括以下步骤：

1)拟胚体的培养：通过三维悬浮培养的方式对人诱导多能干细胞(iPS细胞)进行培养，形成拟胚体(EBs)；

2)施加待筛选药物；

3)通过分析拟胚体发育的指标筛选和/或评价所述药物。

进一步地，所述步骤1)中拟胚体的培养，具体步骤为：

S1.通过将外源因子组合OCT4、SOX2和KLF2导入正常人的尿上皮细胞重新编程获得诱导多能干细胞；

S2.将步骤(1)中的诱导多能干细胞转移至以Matrigel为基质代替饲养层细胞的无血清STEMdiff^TM的培养基中，培养4～5天后，用EDTA消化液直接消化细胞；