[发明专利]一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞

权利要求书

1.一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，将新冠病毒的易感基因ACE2插入干细胞DNA中，制备易被新冠病毒感染的易感干细胞，进而将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入所制易感干细胞DNA中，构建既能通过ACE2将新冠病毒吸入干细胞内又能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在干细胞内复制的RNA干扰干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、肺干细胞或诱导肺干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述插入基因包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒的包装、干细胞的慢病毒转染、RNA干扰干细胞的筛选和鉴定。

4.根据权利要求1、3所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA和/或将新冠病毒易感基因ACE2克隆到慢病毒载体的多克隆位点。

5.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。

6.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物为：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。

7.根据权利要求1所述的一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，按以下步骤制备：

(1)获得间充质干细胞：从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中获得间充质干细胞和/或羊水成纤维细胞，筛选或诱导成肺干细胞。

(2)给干细胞装配新冠病毒易感基因：将血管紧张素转换酶II基因连接慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或者将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒OE-ACE2或FU-ACE2，将重组慢病毒转染干细胞，使ACE2基因整合到干细胞DNA。

(3)给干细胞装配新冠病毒RNA干扰基因：优选新冠病毒(nCoV)的靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或者将重组质粒LV3-nCoV-N-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染干细胞，使shRNA基因整合到干细胞DNA上，使干细胞获得能干扰nCoV在胞内复制的新功能。

(4)制成一种人工装配新冠病毒易感基因和新冠病毒RNA干扰基因从而兼具干细胞天然治疗功能、新冠病毒易感特性和RNA干扰功能的干细胞。