[发明专利]一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞

说明书

一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，其特征在于，从干细胞样本库或日常实验后剩余的样本中获得间充质干细胞或羊水成纤维细胞，筛选、诱导成干细胞，然后将新冠病毒的易感基因ACE2插入干细胞DNA中，制备易被新冠病毒感染的易感干细胞；进而将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入所制易感干细胞DNA中，构建既能通过ACE2将新冠病毒吸入干细胞内又能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在干细胞内复制的用于治疗COVID‑19的RNA干扰干细胞。

技术领域

本发明涉及一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞，属于生物医学领域的传染病防治技术。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS-CoV-2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。

目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞(NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF-КB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以功能改造的干细胞治疗COVID的文献报道。

文献报道，SARS-CoV能在ACE2转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS-CoV-2也通过ACE2受体感染宿主细胞。在传统观念上，通常不希望SARS-CoV-2通过ACE2受体感染机体细胞和治疗用干细胞，本发明以相反的思路，构建表达ACE2的重组载体，转染干细胞，以增强干细胞表达ACE2功能，从而增强干细胞对SARS-CoV-2 的易感性，使干细胞在治疗中与宿主细胞竞争吸入较多的新冠病毒，以减少机体正常组织感染机会，然后通过人工装配在干细胞DNA的RNA干扰基因抑制、杀灭被ACE2吸引入干细胞内的新冠病毒。

RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶(Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但尚未见以人工构建的具有RNA干扰功能的干细胞为载体制备新冠病毒疫苗的报道。

发明内容

基于目前治疗用干细胞的问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是制备一种人工装配新冠病毒易感基因和RNA干扰基因的RNA干扰干细胞。