[发明专利]一种单管同时检测2019-nCov病毒Orf1ab、E及N区域的引物和方法

权利要求书

1.一种实时荧光定量PCR法检测2019-nCov病毒的引物和探针，其特征在于，包括扩增覆盖2019-nCov病毒核酸的Orf1ab、E及N三个区域的上下游引物和Taqman荧光探针，分别是Orf1ab-F、Orf1ab-R、Orf1ab-Probe；E-F、E-R、E-Probe；N-F、N-R、N-Probe；其碱基序列为：

orflab-F：5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3'；

orflab-Pro：5’-FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BHQ1-3’；

orflab-R：5’-ACACTATTAGCATAAGCAGTTGTGG-3’；

E gene-F：5’-CGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGT-3’；

E gene-Pro：5’-TAMRA-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ2-3’；

E gene-R：5’-TATTGCAGCAGTACGCACACA-3’；

N gene-F：5’-AAGATCACATTGGCACCCG-3’；

N gene-Pro：5’-HEX-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BHQ1-3’；

N gene-R：5’-CGTGATGAGGAACGAGAAGAG-3’。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括检测内标基因Rnase P用上下游引物和探针分别是Rnase P-F、Rnase P-R、Rnase P-Probe；其碱基序列为：

Rnase P-F：5’-GATTTGGACCTGCGAGCG-3’；

Rnase P-Pro：5’-ROX-ACCTGAAGGCTCTGCGCGGACT-BHQ2-3’；

Rnase P-R：5’-ACTGAATAGCCAAGGTGAGCG-3’。

3.如权利要求1或2所述的引物和探针，其特征在于，Taqman荧光选自FAM、TAMRA、HEX和ROX四种荧光。

4.一种检测2019-nCov病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)用病毒RNA提取试剂提取待检标本的病毒RNA；

(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；

(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，同时加入权利要求1至3之一所述的引物和探针同时添加到同一个反应管中；

(4)根据荧光扩增曲线，判断样本中是否存在2019-nCov或SARS-Cov-2病毒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Orf1ab、E、N和Rnase P上下游引物及探针的混合及比例：将Orf1ab、E、N和Rnase P上下游引物和探针分别稀释为10μM，其中Orf1ab-F、E-F、N-F、Rnase P-F引物按10：6：8：5比例混合为Forward Mix引物试剂；Orf1ab-R、E-R、N-R、Rnase P-R引物按12：6：10：5比例混合为Reverse Mix引物试剂；Orf1ab-Probe、E-Probe、N-Probe、Rnase P-Probe探针按1：3：4：1比例混合为Probe Mix引物试剂。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，若待测样本四条荧光扩增曲线均超过阈值线，且CT值小于38，则判断为阳性；若只有Rnase P荧光扩增曲线超过阈值线，且CT值小于38，其他三条荧光无明显扩增曲线，则判断为阴性。