[发明专利]一种酸性α淀粉酶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种酸性α淀粉酶，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；

所述一种酸性α淀粉酶的制备方法包括以下步骤：

1）设计并合成扩增酸性α淀粉酶基因的引物，其序列如下：

上游引物Amy2863F：

5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGGCTCACCGACACCAGCG-3’

下游引物Amy2863R：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAGGCGATCCGCCGCTC-3’

2）PCR扩增及重组质粒的构建：

用Amy2863F和Amy2863R引物，以Microbacterium hydrothermale MCCC 1A05925的基因组DNA为模板进行扩增；PCR扩增的产物与经限制性内切酶NdeI和EcoR I酶切后pET-28a表达载体连接，将连接产物转化至大肠杆菌，PCR产物经限制性内切酶Nde I和EcoR I酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-28a上，将连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选含有α淀粉酶基因的重组质粒，并进行核酸电泳和测序验证；

所述PCR扩增的条件如下：95℃预变性3min；95℃ 15s，65℃ 15s，72℃ 90s，72℃5min, 28个循环；

3）α淀粉酶的表达与纯化

将含有α淀粉酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21，用低浓度IPTG低温诱导α淀粉酶蛋白表达，之后蛋白纯化得到酸性α淀粉酶；

所述纯化采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化。

2.如权利要求1所述一种酸性α淀粉酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）设计并合成扩增酸性α淀粉酶基因的引物，其序列如下：

上游引物Amy2863F：

5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGGCTCACCGACACCAGCG-3’

下游引物Amy2863R：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAGGCGATCCGCCGCTC-3’

2）PCR扩增及重组质粒的构建：

用Amy2863F和Amy2863R引物，以Microbacterium hydrothermale MCCC 1A05925的基因组DNA为模板进行扩增；PCR扩增的产物与经限制性内切酶NdeI和EcoR I酶切后pET-28a表达载体连接，将连接产物转化至大肠杆菌，PCR产物经限制性内切酶Nde I和EcoR I酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-28a上，将连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选含有α淀粉酶基因的重组质粒，并进行核酸电泳和测序验证；

所述PCR扩增的条件如下：95℃预变性3min；95℃ 15s，65℃ 15s，72℃ 90s，72℃5min, 28个循环；

3）α淀粉酶的表达与纯化

将含有α淀粉酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21，用低浓度IPTG低温诱导α淀粉酶蛋白表达，之后蛋白纯化得到酸性α淀粉酶；

所述纯化采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化。

3.如权利要求1所述一种酸性α淀粉酶在纺织、造纸、洗涤剂、发酵和食品工业中的应用。