[发明专利]一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法

权利要求书

1.一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，其特征在于，制备步骤如下：（1）提取待测样本的总RNA作为模板；（2）设计用于病原体核酸多重检测的引物和探针组；（3）配制荧光RMA反应体系，向反应体系中加入提取的总RNA，进行反转录和RMA扩增反应；（4）检测结果判定：根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有某种病原体核酸。出现相应的扩增曲线表示待测样本含有该种病原体核酸，表现为阳性结果；不出现相应的扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到该种病原体核酸，表现为阴性结果。

2.如权利要求1所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述的核酸的引物长度一般为30-35 bp，GC含量占40-60%，5’端的3-5个核苷酸不可多于两个G，3’端应有G和C且连续的三个核苷酸不可相同。

3.如权利要求1所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，其特征在于，所述步骤（2）所述的核酸探针长度为46-52 bp，包括携带有荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸（T）和携带有猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸（T），中间由一个四氢呋喃碱基(THF)隔开，荧光基团与猝灭基团间隔2-5个碱基；所述荧光基团用FAM、HEX、ROX等修饰，所述淬灭基团用BHQ修饰；所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

4.如权利要求1所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述的扩增反应试剂包括以下组分：

各组分浓度如上表。

5.如权利要求1所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，其特征在于，所述步骤（3）中扩增反应在温度设定为42℃的荧光检测器中进行，反应时间为20min。

6.如权利要求1所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，其特征在于，该方法可用于血清、血浆、全血、口咽拭子、鼻咽拭子、细菌、真菌、各种组织细胞和尿液中核酸的检测。

7.如权利要求1所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有：扩增反应试剂、扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁溶液、阳性质控品和阴性质控品；所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。

8.如权利要求7所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法用试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有待检病原体的扩增基因序列的重组质粒。

9.如权利要求7所述的一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法用试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为无菌双蒸水；所述试剂盒可同时快速检测多种病原体。