[发明专利]一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法

说明书

本申请属于生物的检测技术，具体为一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，制备步骤如下：（1）提取待测样本的总RNA作为模板；（2）设计用于病原体核酸多重检测的引物和探针组；（3）配制荧光RMA反应体系，向反应体系中加入提取的总RNA，进行反转录和RMA扩增反应；（4）检测结果判定：根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有某种病原体核酸。出现相应的扩增曲线表示待测样本含有该种病原体核酸，表现为阳性结果；不出现相应的扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到该种病原体核酸，表现为阴性结果。

技术领域

本申请属于生物的检测技术，具体为一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法。

背景技术

现有检测病原体的实验方法主要是荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光法和培养法等。PCR技术由于检测灵敏度高，适用范围广，操作简便等原因应用广泛，但其程序复杂、需要精密的仪器、检测时间较长，不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。酶联免疫吸附试验虽然操作较为简便，但由于敏感度不高、影响因素较多，易造成假阴性或者假阳性等因素限制了其在临床上的应用。间接免疫荧光法针对的是病原体引起机体产生的特异性抗体，而抗体检测有窗口期，在发病初期容易漏诊，且灵敏度和特异性较低，判定结果需要借助荧光显微镜，操作较复杂。培养法一直被认为是病原体检测的“金标准”而受到临床医生的青睐，但因其操作步骤复杂、培养时间长、技术难度大、阳性率低等缺点而很难在基层医院推广应用。

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Mediated Amplification, RMA）技术是一种核酸等温扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶三种酶。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA技术具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原体的检测中。

针对现有技术中存在的问题，本发明研发并评估了用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，可用于快速检测多种病原体核酸。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光RMA方法，制备步骤如下：（1）提取待测样本的总RNA作为模板；（2）设计用于病原体核酸多重检测的引物和探针组；（3）配制荧光RMA反应体系，向反应体系中加入提取的总RNA，进行反转录和RMA扩增反应；（4）检测结果判定：根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有某种病原体核酸。出现相应的扩增曲线表示待测样本含有该种病原体核酸，表现为阳性结果；不出现相应的扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到该种病原体核酸，表现为阴性结果。

优选的，所述步骤（2）中所述的核酸的引物长度一般为30-35 bp，GC含量占40-60%，5’端的3-5个核苷酸不可多于两个G，3’端应有G和C且连续的三个核苷酸不可相同。

优选的，所述步骤（2）所述的核酸探针长度为46-52 bp，包括携带有荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸（T）和携带有猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸（T），中间由一个四氢呋喃碱基(THF)隔开，荧光基团与猝灭基团间隔2-5个碱基；所述荧光基团用FAM、HEX、ROX等修饰，所述淬灭基团用BHQ修饰；所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。当探针与扩增产物结合时，核酸外切酶III识别THF碱基位点，将荧光基团和淬灭基团分开，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步，达到实时监测的效果。

优选的，所述步骤（3）中所述的扩增反应试剂包括以下组分：