[发明专利]一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针，其特征在于，所述的单苯环荧光探针的结构式如下：

2.一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的具体步骤为：

(1)将4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸分别进行羧基保护反应；

(2)将步骤(1)得到的羧基保护产物分别进行磷酸化反应、酰胺化反应、酯化反应；

(3)将步骤(2)得到的产物分别进行解保护反应，相应得到式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)所示的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的羧基保护反应的具体操作步骤为：向含有4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸的圆底烧瓶中加入无水DMF和NaHCO₃，室温下搅拌10-30分钟；然后加入苄基溴，55-60℃下搅拌反应2-8小时后用水淬灭反应，用DCM萃取有机化合物，合并有机层，用饱和盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，最后旋转蒸发除去溶剂得到羧基保护产物；其中4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸、NaHCO₃和苄基溴的摩尔比为1:2-4:3-5。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的磷酸化反应的具体操作步骤为：向步骤(1)得到的羧基保护产物的THF溶液中加入CCl₄，冷却至0℃，然后在N₂下滴加N,N-二异丙基乙胺，混合搅拌10-30分钟后逐滴加入4-二甲基氨基吡啶和磷酸二苄基酯的THF溶液，滴加完成后加热至室温搅拌反应2-8小时；用磷酸二氢钠的磷酸盐缓冲液淬灭反应，继续搅拌10-50分钟，最后用DCM萃取，用盐水洗涤有机层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发除去溶剂，使用洗脱剂纯化残余物；其中步骤(1)得到的羧基保护产物、CCl₄、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨基吡啶和磷酸二苄基酯的摩尔比为1:8-12:0.5-1.5:0.08-0.2:1-3。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的酰胺化反应的具体操作步骤为：在0-(-20)℃，向步骤(1)得到的羧基保护产物的THF溶液中加入4-二甲基氨基吡啶和二乙基氨基甲酰氯，然后加热至室温并搅拌反应2-8小时，用磷酸二氢钠的磷酸盐缓冲液淬灭反应，继续搅拌10-50分钟，最后用DCM萃取，用盐水洗涤有机层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发除去溶剂，使用洗脱剂纯化残余物；其中步骤(1)得到的羧基保护产物、4-二甲基氨基吡啶和二乙基氨基甲酰氯的摩尔比为1:1-3:1-2。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的酯化反应的具体操作步骤为：向步骤(1)得到的羧基保护产物的THF溶液中滴加N,N-二异丙基乙胺，搅拌10-50分钟后继续滴加含有4-二甲基氨基吡啶和乙酸酐的THF溶液，搅拌反应2-8小时，用磷酸二氢钠的磷酸盐缓冲液淬灭反应，继续搅拌10-50分钟，最后用DCM萃取，用盐水洗涤有机层，无水Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发除去溶剂，使用洗脱剂纯化残余物；其中步骤(1)得到的羧基保护产物、N，N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨基吡啶和乙酸酐的摩尔比为1:0.5-2:1-3:1-3。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的解保护反应的具体操作步骤为：向磷酸化反应产物的甲醇溶液中添加催化剂Pd/C，在室温下搅拌反应1-5天，过滤除去催化剂，甲醇洗涤，蒸发除去溶剂，最后用乙醚洗涤。