[发明专利]一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用。本发明利用分子内氢键的断裂/生成所引起的荧光发射的变化，通过对单苯环分子上的羟基基团进行化学修饰，得到了具有良好水溶性的单苯环荧光探针。荧光探针与酶反应后，释放出羟基并与相邻基团生成分子内氢键，从而产生荧光发射红移。本发明制备的单苯环荧光探针具有高选择性，高稳定性，高灵敏度，较低的检出限和良好的生物相容性，可用于内源性酶的检测。此外，本发明设计的单苯环荧光探针，制备方法简单，原料廉价易得，成本低，制备的产品产率高，适合大规模推广应用。

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，特别涉及一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

细胞代谢的调控是生命活动的基础，其中大部分都是由酶来催化控制的。生物酶通过调节细胞内生化反应的速率，控制多种生理过程的进行，在维持正常的细胞生理活动中起着关键作用。如果没有酶的存在，许多重要的生化反应将以无法维持生命的速率进行。研究表明，某些酶的活性异常与一些重大疾病如癌症等的发生密切相关，常常被作为相关疾病诊断和药物发现的生物标志物。因此，发展快速、灵敏、准确的检测生物酶活性的分析方法，对于疾病的早期诊断和精确治疗具有重要的意义。基于有机小分子荧光探针具有高灵敏度、高选择性、快速的响应时间以及对生物无破坏性等优点，在生物酶的检测中受到了广泛关注。

目前报道的有机小分子荧光探针多是一些多苯环的有机小分子荧光探针，与多苯环分子相比，具有易制备，高稳定性和低成本等优点的单苯环有机小分子却由于其荧光发射大都在紫外区而不适用于荧光传感。但单苯环分子具有的较小尺寸可能会与目标(如：蛋白质和DNA)结合的更加灵敏。换句话说，单苯环分子可能作为一类新型有机探针，对分析物的检测提供新的途径。因此，设计和合成具有可见或近红外荧光发射的单苯环分子至关重要。

发明内容

本发明利用分子内氢键来调控单苯环分子的荧光性质，从而提供一种用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针及其制备方法，并且将该类单苯环荧光探针成功的应用于HeLa细胞中碱性磷酸酶的生物成像，探针光稳定性好，在活细胞成像中光信号稳定。

本发明所述的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针的结构式如下：

本发明所述的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针的制备方法为：

(1)将4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸分别进行羧基保护反应；

(2)将步骤(1)得到的羧基保护产物分别进行磷酸化反应、酰胺化反应、酯化反应；

(3)将步骤(2)得到的产物分别进行解保护反应，相应得到式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)所示的用于检测生物酶的比率型单苯环荧光探针。

上述各步骤反应如下反应式所示：

步骤(1)所述的羧基保护反应的具体操作步骤为：向含有4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸的圆底烧瓶中加入无水DMF和NaHCO₃，室温下搅拌10-30分钟；然后加入苄基溴，55-60℃下搅拌反应2-8小时后用水淬灭反应，用DCM萃取有机化合物，合并有机层，用饱和盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，最后旋转蒸发除去溶剂得到羧基保护产物；其中4,6-二羟基间苯二甲酸或2,5-二羟基对苯二甲酸、NaHCO₃和苄基溴的摩尔比为1:2-4:3-5。