[发明专利]一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法

权利要求书

1.一种编码烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述基因编码的NtARF6蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.包含权利要求1所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求3所述的重组表达载体的制备方法如下：提取4-5叶烟苗总RNA，接着反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增NtARF6基因；将NtARF6扩增产物经BamH I和Hind III双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒pBI121-NtARF6。

5.一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用权利要求4所述的重组表达载体转化大肠杆菌细胞，得到表达NtARF6蛋白的重组原核表达菌株PBI121- NtARF6-BL21；

(2)利用步骤（1）所述菌株PBI121-NtARF6-BL21生产重组NtARF6蛋白，具体为：将菌株PBI121-NtARF6-BL21接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养过夜，按照1:100接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养至OD600达到0.6-0.8，然后加入IPTG至终浓度为0.1-1.0mM，20-37℃，220转/分培养2小时以上离心并收集菌体，超声破碎后、离心、收集上清，经分离纯化得到重组NtARF6蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：将分离纯化得到的重组鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白加入到透析袋中，在20mMPB, 0.5mM NaCl ,0.5mM EDTA,pH8.0进行透析过夜；然后把透析后的蛋白溶液加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时，去掉滤出液，得到重组NtARF6蛋白。