[发明专利]一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法

说明书

本发明首公开了一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法，到目前为止，尚未有人体外表达过NtARF6蛋白，而本发明通过基因工程方法，本发明首次成功表达纯化了NtARF6蛋白。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法。

背景技术

烟草是重要的经济作物，是切克一年生草本植物。烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95％左右。

ARF(Auxin Response Factor)类型的转录因子基因是普通烟草生长发育过程当中重要的调控因子。近年来，随着基因组和测序技术的发展，正向调控烟草尼古丁生物合成调控因子已经基本明确，而且相关分子调控机理也逐渐清晰。相比之下，烟草中能够负向调控尼古丁生物合成的调控因子却鲜见报道。具相关文献报道，负向调控烟草尼古丁合成基本上是通过直接或间接影响不同植物激素之间的互作来实现的，比如生长素(IAA)、乙烯利(Ethylene)。我们通过对乙烯利处理后烟草根部组织转录组进行分析后获得NtARF6基因表达模式和NtARF6与相关尼古丁合成代谢酶转录组共表达分析的结果，确定了NtARF6与尼古丁合成直接相关，相关应用实践结果表明过表达NtARF6能够显著降低烟草烟叶中四种生物碱的含量，此结果为利用植物基因工程技术降低烟叶中生物碱含量提供了靶标基因。

发明内容

针对现在技术的不足，本发明的目的是提供一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

本发明保护一种编码烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还保护上述基因编码的NtARF6蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还保护包含上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明还保护上述重组表达载体的制备方法。

其中，所述重组载体的制备方法如下：提取4-5叶烟苗总RNA，接着反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增NtARF6基因；将NtARF6扩增产物经BamH I和Hind III双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒pBI121-NtARF6。

本发明还保护一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法，包括以下步骤：

(1)用上述重组表达载体转化大肠杆菌细胞，得到表达NtARF6蛋白的重组原核表达菌株PBI121-NtARF6-BL21；

(2)利用步骤(1)所述菌株PBI121-NtARF6-BL21生产重组NtARF6蛋白，具体为：将菌株PBI121-NtARF6-BL21接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养过夜，按照1:100接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养至OD600达到0.6-0.8，然后加入IPTG至终浓度为0.1-1.0mM，20-37℃，220转/分培养2小时以上离心并收集菌体，超声破碎后、离心、收集上清，经分离纯化得到重组NtARF6蛋白。

优选的，将分离纯化得到的重组鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白加入到透析袋中，在20mMPB,0.5mM NaCl,0.5mM EDTA,pH8.0进行透析过夜；然后把透析后的蛋白溶液加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时，去掉滤出液，得到重组NtARF6蛋白。