[发明专利]一种CHO-DHFR+细胞株及其应用

说明书

本发明提供了一种CHO‑DHFR+细胞株及其应用。该细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019264。本发明的CHO‑DHFR+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物NHsubgt;4/subgt;supgt;+/supgt;的积累，细胞倍增水平高、细胞活力高。采用含IL‑10基因序列的pcDNA3.1‑β重组质粒载体转染该CHO‑DHFR+细胞株，能够获得表达重组IL‑10的工程细胞株，通过含有G418的CD OptiCHO培养基培养，高效表达重组IL‑10蛋白，重组IL‑10蛋白的瞬转表达量大于0.96mg/L，有较好的商业应用价值。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种CHO-DHFR+细胞株及其应用。

背景技术

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞，因为与其他系统相比，CHO细胞具有以下优点：①CHO细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能，因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；②CHO细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强，可根据培养要求选择可贴壁培养或悬浮培养的方式；③整合外源基因后的细胞稳定，重组基因能高效扩增和表达；④表达的目的蛋白可由细胞内运输到细胞外，并且CHO细胞只表达少量的内源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市场上一半以上最为畅销的生物制剂是由CHO细胞产生的。如，阿达木单抗(Humira)、贝伐单抗(Avastin)和利妥昔单抗(Rituxan)。可以说，CHO细胞对现代生物药工业发展做出了不可磨灭的贡献。

目前CHO细胞在工业上的筛选类型有：

①二氢叶酸还原酶营养缺陷突变细胞株(代表细胞CHO-DG44(Thermo),CHO-DUXB11(Chasin Lab))：DHFR是dihydrofolate reductase的缩写。该细胞系为DHFR基因缺陷型。DHFR用于催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。突变体不能合成四氢叶酸。因而不能在缺乏次黄嘌呤(Hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)的培养基上生长。只有导入DHFR或者培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶才能生长。因此DHFR可作为筛选标记或报告基因。

CHO-DG44在1983年诞生。CHO-DG44具有DHFR双缺陷，被敲除了2个位点。DG44可用于筛选，在工业使用也最广泛。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的拮抗剂，可使DHFR大量表达，因此可使细胞外源基因的拷贝数扩增并得到较高表达。

DHFR基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。但该系统也存在一些不足，如该方法需要较高浓度的MTX，而外源基因表达水平不高，增加了筛选细胞克隆的工作量等。

②谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统(代表细胞CHOK1SV-KO(Lonza)，CHOZN(Merk)，CHO-S(Thermo))是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，速度快，稳定性好，产量高等优势，同时该系统由于不需要额外谷氨酰胺的添加导致了更低的代谢废物氨的含量，更好的细胞活率，更有利于后续的工业化生产，但使用成本较高。

CN107760650A公开了一种经改造的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及其用途，所述经改造的CHO细胞能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度生长，并且优选地不表达功能性的谷氨酰胺合成酶和岩藻糖基转移酶8。该方法敲除了CHO细胞的内源性GS基因，因此，后续培养过程中需要在培养基中补加较大量的谷氨酰胺，而谷氨酰胺不稳定，4℃下放置7天即可分解约50％，而且降解产物不利于细胞生长。

发明内容