[发明专利]从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法

权利要求书

1.从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，包括预处理步骤和获取步骤，所述围产期组织为胎儿足月娩出后的围产期组织，所述预处理步骤是指对围产期组织进行处理以制得围产期组织细胞混悬液，其特征在于，所述获取步骤包括：

步骤A. 向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠以对经预处理的围产期组织细胞进行标记，富集，获取含有阴性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第一免疫磁珠为CD31免疫磁珠；

步骤B. 向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠以对步骤A所得的细胞亚群进行标记，富集，获取阳性表达的细胞亚群混悬液；其中，所述第二免疫磁珠为CD146免疫磁珠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述第二免疫磁珠替换为NG2免疫磁珠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述围产期组织细胞混悬液包括PBS缓冲体系，所述PBS缓冲体系含有EDTA，所述EDTA的浓度为1-6 mmol /L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述第一免疫磁珠的加入量为每1000万细胞加入15-30μL第一免疫磁珠；所述第二免疫磁珠的用量与第一免疫磁珠的用量相同。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠之前加入Fc受体阻断剂，所述Fc受体阻断剂的加入量为：每1000万细胞加入20μL Fc受体阻断剂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤A所述“向所述围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠以对经预处理的围产期组织细胞进行标记”包括：向围产期组织细胞混悬液中加入第一免疫磁珠后摇匀，使围产期组织细胞与第一免疫磁珠复合，形成第一复合体，制得第一复合体混悬液；

步骤A所述“富集”包括：使第一复合体混悬液通过磁场，以使第一复合体被磁力吸引；

步骤A所述“获取表达阴性的细胞亚群混悬液”包括：弃去被磁力吸引的第一复合体，获取通过磁场后的细胞混悬液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤B所述“向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠以对步骤A所得的细胞亚群进行标记”包括：向步骤A制得的细胞亚群混悬液中加入第二免疫磁珠后摇匀，使步骤A制得的细胞亚群混悬液中的细胞与第二免疫磁珠复合形成第二复合体，制得第二复合体混悬液；

步骤B所述“富集”包括：使第二复合体混悬液通过磁场，以使第二复合体被磁力吸引；

步骤B所述“获取表达阳性的细胞亚群混悬液”包括：脱离磁场，获取被磁力吸引的第二复合体，用PBS冲洗，即得所述多能血管祖细胞。

8.根据权利要求6-7中任一所述的方法，其特征在于：所述围产期组织细胞混悬液和/或第一复合体混悬液和/或第二复合体混悬液的温度为2-8℃。

9.根据权利要求6-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述摇匀之后静置15min。

10.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述预处理步骤包括洗涤、切碎和消化，所述洗涤是指先用乙醇进行漂洗，再用含有抗生素的PBS缓冲液进行洗涤；所述切碎包括：将围产期组织切至平均体积为1.0 mm³；所述消化包括：用生物酶将切碎的围产期组织消化成彼此独立分开的单个细胞，形成每1ml含有10-20万围产期组织细胞的混悬液。