[发明专利]从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法

说明书

本发明提供一种从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法，包括预处理步骤和获取步骤，所述获取步骤利用两种不同配基的免疫磁珠对围产期组织细胞进行标记和纯化，先利用第一免疫磁珠进行标记，通过表达阳性来识别出非多能血管祖细胞，除去杂质细胞，得到较高浓度的含有多能血管祖细胞的细胞群，再通过第二免疫磁珠对除杂后的围产期组织细胞进行标记，通过表达阳性来识别进而获取得到多能血管祖细胞。本发明制得的多能血管祖细胞既具有同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，又与骨髓间充质干细胞具有相同的中胚层细胞分化功能，还具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，并且可以保持细胞形态与扩增能力。

技术领域

本发明属于生物医学研究领域，具体涉及一种从围产期组织中纯化获取多能血管祖细胞的方法。

背景技术

围产期组织是指怀孕28周到婴儿出生这一段时间所产生的与胎儿发育相关的附属器官组织，主要包括脐血、脐带和胎盘。胎儿足月娩出后的围产期组织具有实足年龄小，基因突变率低，通常是作为生物废物丢弃，可以在对胎儿和母亲没有任何风险的情况下获取，获取途径不会对人体造成伤害等优点。围产期组织因为含有多种干细胞和特定组织祖细胞亚群，且资源丰富，扩增能力强，不会引起伦理问题等众多优势，成为了再生医学研究领域关注的焦点。所以，围产期组织以其充足的供应，便捷的来源，以及最小程度的道德与法律的纷争成为了获取干细胞的良好来源。

多能血管祖细胞是一类具有自我更新、自我复制能力和多分化潜能的血管相关组织来源细胞，既具有骨髓间充质干细胞特性和功能同时又具有向心血管细胞分化能力与心血管细胞支持能力，并具有高度的增殖潜能和中胚层细胞分化能力。这类细胞主要分布于骨髓和围产期组织中，通常与血管周细胞和血管干细胞的功能和特性相似。

免疫磁珠是一种大小均一，表面配有特定化学基团的磁性微球。从结构上来说，分为三部分，中心部分由磁性物质构成，如γ-Fe2O3、Fe3O4和MeFe2O3，使磁性微球在磁场作用下能被磁场吸引，从而快速聚集；中间层由聚苯乙烯、聚乙烯亚胺或聚丙烯酸等高分子材料包裹，保证磁性的密封性良好，不出现漏磁现象；同时，根据不同用途可制成不同粒度大小，又因制备材料和方法不同，可使其表现具有疏水或亲水、非极性或极性、带正电荷或带负电荷等不同的物理性质，还可以添加颜料、染料、荧光物质、放射性标记以及磁性氧化铁等，以适用于各种检测和分离目的。微球表面还配有特定的化学基团，通常为抗原、抗体或凝集素等免疫配基，配基具有生物专一性的特点，能通过共价结合抗体蛋白上的氨基或羧基基团。

免疫磁性分离技术(immunomagnetic separation IMS)是近年来国内外研究的一种新的免疫学技术，能够从大量外周血中筛选出带有特异性标记的细胞，其基本原理是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠免疫复合物，该复合物在外加磁场的作用下发生力学移动，将含有靶抗原的目标细胞与其他细胞分离，从而达到特异性分离细胞的目的。由于免疫磁珠富集法具有固相化试剂特有的优点和免疫学反应高度专一性的特点，在三十余年的发展中，已较为成熟的应用于分离及浓缩特定细胞、微生物、蛋白质和核酸片段等肉眼难以观察或样品中含量不高的物质，其应用随着各个科学领域的发展而日趋全面和深入。目前该项技术在细胞分离及微生物学检测等方面均取得了较大的进展。随着抗体技术的发展，免疫磁珠富集技术已成为细胞分选和蛋白质组学研究的重要技术支持和临床及细胞产品纯化的主要手段。目前，基于免疫磁性原理富集或同时检测CTCs的技术主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪(magnetriccell sorting,MACS)、AdnaTest癌细胞检测系统和莱尔系统等。其中CellSearch检测系统已经被美国FDA批准用于检测乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者外周血的CTCs。该系统利用EpCAM抗体结合表达EpCAM的肿瘤细胞，然后用免疫磁珠来覆盖抗EpCAM抗体，最后在磁场的作用下对CTCs进行分离。