[发明专利]用于检测大肠杆菌F17菌毛黏附素基因的LAMP引物及其应用

说明书

本发明公开了一套用于鉴定大肠杆菌F17菌毛黏附素基因的环介导等温扩增(LAMP)引物，以及基于该引物所建立的荧光定量LAMP检测方法。所述引物包括2条外引物、2条内引物及2条环引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2‑7所示。本发明用于大肠杆菌F17黏附素基因即F17抗原型的鉴定，具有方法灵敏度高、特异性强，操作简单快速等优点。

技术领域

本发明属于动物分子生物学领域，具体涉及一种鉴定大肠杆菌F17菌毛黏附素基因的LAMP引物及荧光定量LAMP检测方法。

技术背景

犊牛腹泻是世界范围内的常见疾病，严重影响奶牛和肉牛养殖业的健康发展。大肠杆菌F17抗原型最早由法国人Girardeau等在对分离自犊牛腹泻的大肠杆菌进行附着实验时发现，它与犊牛腹泻密切相关，F17菌毛是牛源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)常见的黏附素之一，近年来的流行病学数据也显示，F17抗原型大肠杆菌在致犊牛腹泻大肠杆菌所占比例越来越高，造成了巨大的经济损失。Kolenda等综述了1951-2013年间27个国家106篇论文中犊牛大肠杆菌毒力相关因子的研究，大肠杆菌F17在2328份犊牛腹泻样品中检出率达到31.57％。

然而，目前国内外用于大肠杆菌F17菌毛黏附素基因检测的方法主要是PCR方法，越来越多的研究报道显示，PCR的灵敏度具有一定的局限性。在大肠杆菌F17抗原型的检测中，会出现漏检的可能性。因此，急需一种高灵敏度，且操作简便快捷的方法来弥补现有检测方法的不足。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在恒定温度55-70℃范围内，利用BstDNA聚合酶的链置换活性完成DNA扩增的分子生物学检测方法。传统的LAMP方法具有高度的敏感性，但由于其产物很容易产生气溶胶污染，因此常会出现假阳性结果。荧光定量LAMP方法利用染料法qPCR的原理，在LAMP反应体系中加入1μL EvaGreen染料，即可在荧光定量PCR仪上观察分析扩增结果；与传统LAMP方法相比，荧光定量LAMP方法不仅在操作过程中全程无需打开管盖，显著降低了气溶胶污染风险，还可以通过不同浓度阳性模板的扩增时间做相对定量的分析，具备反应快捷，灵敏度高，污染风险低等特征，具有用于疾病诊断的潜在价值。

发明内容

本发明的目的是以荧光LAMP检测方法为基础，设计一套用于F17菌毛黏附素基因的特异性LAMP引物，并建立一种鉴定大肠杆菌F17菌毛黏附素基因的荧光定量LAMP检测方法，可用于鉴定大肠杆菌F17抗原型并提高检测效率和灵敏度。

为了实现本发明的目的，本发明提供用于鉴定大肠杆菌F17菌毛黏附素基因的荧光定量LAMP检测的引物，其核苷酸序列为：

内引物：FIP：5'-TCATCGCGGTACCCCTGGAATAATTTATGGGCTGACGGAGGA-3'(SEQ IDNo.2)

内引物：BIP：5'-TGTCTTTTCCGGATGGTGCGTCCGGTCTTACGTGAACAGAC-3'(SEQ IDNo.3)

外引物：F3：5'-AGTCTTGACGGGCAGAGT-3' (SEQ ID No.4)

外引物：B3：5'-CACTGTATTGCGCAGAGGAA-3' (SEQ ID No.5)

环引物：LF：5'-CCCCATCCATATAAGGAGTCCC-3' (SEQ ID No.6)

环引物：LB：5'-GGAAATTATGTATCAACGCAGGGAC-3' (SEQ ID No.7)