[发明专利]一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用有效
| 申请号： | 202011399443.4 | 申请日： | 2020-12-01 |
| 公开（公告）号： | CN112462062B | 公开（公告）日： | 2023-10-03 |
| 发明（设计）人： | 庞希宁;张涛;贺丹;庞然;赵峰 | 申请（专利权）人： | 沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司 |
| 主分类号： | G01N33/573 | 分类号： | G01N33/573;C12N5/071;A61K38/44;A61P17/02 |
| 代理公司： | 沈阳智龙专利事务所(普通合伙) 21115 | 代理人： | 宋铁军 |
| 地址： | 110169 辽宁省*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 羊膜 干细胞 外分泌 蛋白 筛选 鉴定 方法 应用 | ||
1.一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于：步骤如下，
步骤一：羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞的提取、培养与鉴定，分别得到羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞；
步骤二：将步骤一中得到的羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞分别持续培养到P2，分别接种于培养瓶中培养22-26h；用PBS洗2-5次，将培养基换成无血清培养基，22-26h后收集无血清培养基，于-80℃冰箱保存，分别获得羊膜间充质干细胞的条件培养基和羊膜上皮干细胞的条件培养基；
步骤三：分别将步骤二中保存的羊膜间充质干细胞的条件培养基和羊膜上皮干细胞的条件培养基取出、融化、浓缩后，分别进行液相色谱-质谱联用分析，鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞外分泌蛋白，分别进一步筛选出它们的差异表达蛋白，分别对筛选出的差异表达蛋白进行GO、KEGG和蛋白质结构域进行整合分析，鉴定出羊膜干细胞的外分泌蛋白LOXL2。
2.根据权利1所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于：步骤一中羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞的提取、培养与鉴定的具体步骤为：
（1）羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞的提取、培养；
（2）羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞进行流式细胞检测、鉴定；
（3）羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞进行成骨、成脂、成软骨分化诱导。
3.根据权利1所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于：步骤一中通过表面标记物分别鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞。
4.根据权利1所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于：无血清培养基是EpiLife基础培养基中添加0.1-0.3% v/v的牛垂体提取物、0.01-0.03 µg/mL人胰岛素样生长因子、0.15-0.20µg/mL皮质醇、3-5µg/mL的牛转铁蛋白以及0.2-0.4 ng/mL的人表皮生长因子。
5.根据权利1所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于：步骤三中液相色谱-质谱联用分析中二级质谱数据使用Maxquant (v1.5.2.8)进行检索注释。
6.根据权利1所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于：步骤三中，根据鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞外分泌蛋白，以p-value0.05，Log2FC1.5为基础进一步筛选出它们的差异表达蛋白进行GO、KEGG和蛋白质结构域进行整合分析。
7.根据权利1所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，其特征在于：羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞的高表达蛋白包括LOXL2、CTHRC1和LGASL1，且羊膜间充质干细胞的高表达蛋白LOXL2、CTHRC1和LGASL1比羊膜上皮干细胞分泌量高。
8.一种如权利要求1所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的应用，其特征在于：羊膜干细胞外分泌蛋白LOXL2在促进角质形成细胞迁移，促进创面再上皮化的应用。
9.根据权利要求8所述的羊膜干细胞外分泌蛋白的应用，其特征在于：LOXL2作为促进创口愈合和再上皮化药剂的应用。
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