[发明专利]一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用

说明书

本发明涉及一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用，本发明鉴定了羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞外分泌蛋白组，并对结果进行了分析整合，对它们的差异表达蛋白进行了进一步的分析。筛选出对上皮发育和表皮再生的积极因子LOXL2，对后续羊膜干细胞旁分泌作用的研究提供了详实的基础和新的思路。LOXL2为临床大面积难愈合创面的在上皮化提供了新的思路，为更好的挖掘不同羊膜干细胞外分泌蛋白的特点提供了方向。为特异性无细胞敷料的开发与临床应用提供了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及羊膜干细胞外分泌蛋白LOXL2的筛选鉴定和应用。

背景技术

人羊膜是胎膜最内层，其主要由外胚层的羊膜上皮干细胞和中胚层的羊膜间充质干细胞组成。多在胎儿分娩后随胎盘废弃。研究发现：人羊膜可作为一种新型的生物敷料应用于临床急慢性创口的辅助性治疗中。已有研究报道，冷冻或辐照处理后的羊膜组织依然在动物创伤模型或者临床创面的愈合中具有促进创面的愈合、降低炎症反应、减少瘢痕的发生等等方面有显著的疗效。由此证明羊膜旁分泌物质有巨大的研究价值和临床意义。然而，羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞的外分泌蛋白组并尚未明晰。

赖氨酰氧化酶同系物2(lysyl oxidase like 2，LOXL2)作为转录辅阻遏物，并且特异性介导组蛋白H3(H3K4me3)的三甲基化'Lys-4'的脱氨基作用，其是表观遗传转录激活的特异性标记。LOXL2可能通过介导组蛋白H3的脱氨基，与SNAI1的相互作用参与上皮至间质转化(EMT)并参与E-钙粘蛋白CDH1的抑制。当分泌到细胞外基质中时，通过介导纤维胶原和弹性蛋白的前体中的肽基赖氨酸残基的氧化脱氨作用来促进细胞外基质蛋白的交联，并且可以在上皮发育调节，细胞生长控制和血管生成等方面有额外的作用。

对于创伤愈合，角质形成细胞作为表皮的主要组成细胞承担了再上皮化的重要任务。已有文献报道羊膜上皮干细胞的条件培养基促进角质形象细胞迁移，并在小鼠体内实验证明条件培养基有促进创口愈合和再上皮化的作用。而羊膜间充质条件培养基对于再上皮化的机制并未明晰。

发明内容

发明目的：

本发明提出一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用，其目的是从羊膜干细胞外分泌蛋白中筛选鉴定出LOXL2，并验证该蛋白有促进角质形成细胞迁移的作用，促进创面再上皮化，提出LOXL2的一种新应用。

技术方案：

一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，步骤如下，

步骤一：羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞的提取、培养与鉴定，分别得到羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞；

步骤二：将步骤一中得到的羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞分别持续培养到P2，分别接种于培养瓶中培养22-26h；用PBS洗2-5次，将培养基换成无血清培养基，22-26h后收集无血清培养基，于-80℃冰箱保存，分别获得羊膜间充质干细胞的条件培养基和羊膜上皮干细胞的条件培养基；

步骤三：分别将步骤二中保存的羊膜间充质干细胞的条件培养基和羊膜上皮干细胞的条件培养基取出、融化、浓缩后，分别进行液相色谱-质谱联用分析，鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞外分泌蛋白，分别进一步筛选出它们的差异表达蛋白，分别对筛选出的差异表达蛋白进行GO、KEGG和蛋白质结构域进行整合分析，鉴定出羊膜干细胞的外分泌蛋白LOXL2。

步骤一中羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞的提取、培养与鉴定的具体步骤为：

(1)羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞的提取、培养；

(2)羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞进行流式细胞检测、鉴定；

(3)羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞进行成骨、成脂、成软骨分化诱导。