[发明专利]三角帆蚌性别的鉴定方法

说明书

本发明提供了一种三角帆蚌性别的鉴定方法，首先，采集少量的性腺组织样本提取DNA；其次，根据M型COII基因多出的特异性序列设计引物进行PCR扩增；最后，通过琼脂糖凝胶电泳观察条带结果判断雌雄，有条带的是雄性三角帆蚌，没有条带的为雌性三角帆蚌；本发明主要是根据三角帆蚌的基因组双单亲遗传现象，利用M型线粒体基因组中COII基因在雄性性腺中特异性表达的特点，结果简单直观，从而准确地鉴定三角帆蚌的性别；因此，本发明能够有效地针对三角帆蚌早期苗种，快速分辨性别，受样本局限性较小，准确性高；另外，本发明使用DNA样本通过凝胶电泳来判断更加快速简单，无需后续的测序结果，大大缩短检测时间，从而提高了检测效率。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种三角帆蚌性别的鉴定方法。

背景技术

三角帆蚌俗称河蚌、珍珠蚌、三角蚌，是一种淡水双壳类软体动物，属瓣鳃纲，真瓣鳃目，珠蚌科、帆蚌属。它是我国主要的淡水珍珠育珠蚌，国内的淡水珍珠中80％以上都是由其育出。在性成熟三角帆蚌个体中，雌雄间在产珠性能方面存在显著差异，雄性具有更好的育珠能力。挑选出雄性三角帆蚌进行精细化养殖，对珍珠产能的提升具有较大的意义。但在实际生产中，雌雄蚌的性别鉴定仍是一个难题。从形态学来看，对三角帆蚌直观地进行性别鉴定比较困难，有研究发现三角帆蚌雌性鳃丝排列紧密，雄性排列稀疏，通过鳃丝的疏密就能区分雌雄。但是这种方法是建立在人为经验的判断上，适用于有经验的人员，并且该方法只能针对性成熟的且处在繁殖期的三角帆蚌，局限性较大，且鉴定的准确程度不高。此外，若想更好的为后续育珠插核做准备，构建单性别育珠群体，则需尽早的鉴别出三角帆蚌的性别，因此，幼龄三角帆蚌的性别鉴定对于淡水珍珠养殖也是至关重要的。综上所述，建立一种三角帆蚌性别鉴别的方法就显得尤为重要。

在哺乳动物和其他物种中，线粒体的遗传遵循严格的母系遗传，即子代的线粒体全部来源于母系，而在三角帆蚌中存在两种类型的线粒体基因组(mtDNA)，分别是F型线粒体基因组和M型线粒体基因组。雄性三角帆蚌体组织中线粒体基因组为F型，性腺组织线粒体基因组为M型；雌性中线粒体基因组在体组织和性腺组织中均为F型。基于这种特殊的线粒体基因组的遗传模式，通过对比三角帆蚌F型和M型线粒体基因组序列发现，参与编码线粒体基因组的 13个编码基因都存在一定程度上的序列差异，尤其是COII基因的序列差异性最大。M型线粒体基因组COII基因序列比F型线粒体基因组COII基因的5’端多出500bp的特异性序列，并且根据M 型线粒体基因组仅存在于雄性性腺中这一特点，我们开发出一种快速准确的性别鉴定方法。

发明内容

针对现有技术中的不足，与传统方法相比，根据分子生物学的方法判断准确，不局限于样本的时间阶段，能够实现幼龄三角帆蚌性别的精准快速检测，因此本发明提供了一种新的鉴定方法，补足了技术空缺。故本发明的目的是提供一种简单、准确的三角帆蚌性别的鉴定方法，通过对M型线粒体基因组上COII基因简单的PCR扩增就能够确定三角帆蚌的性别，为三角帆蚌的性别鉴定提供便利。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种三角帆蚌性别的鉴定方法，其包括如下步骤：

1.样本采集

根据检测需求选取若干样本，使用不同套的镊子和剪刀等取样工具避免交叉污染，剪取三角帆蚌的50-100mg新鲜性腺组织装入1.5mL灭菌离心管中，快速置于液氮中速冻，采样结束后在-80℃下保存；加入500μL裂解液，用研磨杵充分将组织磨碎，再补充500μL裂解液，开始裂解；在55℃下裂解3-4h至澄清，过程中每0.5-1h翻转摇动一次。

其中，裂解液包括320μL双蒸水ddH₂O、20μL(1mol/L)三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-Hcl、 80μL(0.5mol/L)乙二胺四乙酸二钠EDTA-Na₂；70μL(10wt％)癸二酸二酰肼SDS和10μL (20mg/μL)蛋白酶kProteinase K。

2.DNA提取