[发明专利]一种制备串联重复蛋白质的方法与应用

说明书

本发明提供一种制备串联重复蛋白的方法及其相关产品与应用。本发明制备串联重复蛋白的方法包括将含有名称为单拷贝基因表达盒的双链DNA分子的表达载体导入受体细胞得到重组细胞，提取所述重组细胞的总RNA，翻译所述总RNA得到串联重复蛋白，极大缩减制备长串联重复蛋白的时间。实验证明仅需7天便可获得重复40次的串联重复MaSp1，比传统方法大幅度缩短了的时间。本发明的方法具有实验周期短、节省时间和成本、效率高等特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种制备串联重复蛋白质的方法与应用。

背景技术

串联重复蛋白是氨基酸序列高度重复的蛋白，由串联重复基因表达产生。以往制备串联重复蛋白是通过构建含有串联重复DNA的表达载体，然后表达出串联重复蛋白。目前串联重复DNA表达载体构建采用的方法主要有非对称粘性末端互补法和同尾酶法2种。非对称粘性末端互补法生成的拷贝数较随机，且需要多种酶进行酶切连接。同尾酶法也比较繁琐，需要反复进行酶切连接。两种方法皆费时费力。

蛛丝中的牵引丝蛋白具有很高的强度，在相同重量下，蛛丝的牵引丝强度是钢丝的5倍，人造Kevlar纤维的3倍。同时，蛛丝还有良好的可塑性，这两种特性使其广泛应用的多种领域。在工业领域，例如制备降落伞，防护服，飞行器的复合材料。在生物医药领域，包括伤口缝合线，生物药的运输载体，细胞培养和器官移植的支架。牵引丝主要由蛛丝蛋白MaSp1(major ampullate spidroins 1)和MaSp2(major ampullate spidroins 2)组成。这两种蛋白是高度模块化的蛋白，序列内部有很长的重复序列，两侧序列长度大概有100氨基酸残基。然而，蛛丝很难通过饲养蜘蛛大量获取，因其具有强的领域意识和攻击性。因此，很多研究尝试在其他宿主中表达重组蛛丝蛋白。增加重组牵引丝蛋白的长度是提高蛛丝纺丝机械性能的关键因素之一。自然界中牵引丝蛋白大小为250–320kDa。一位学者在2010年则利用表达大肠杆菌表达出284.9kDa的重组蛛丝蛋白，且纺丝机械性能与天然蛛丝相似。表达184.9kDa的重组蛛丝蛋白需要先合成一个重复单元MaSp1，再利用同尾酶无缝拼接技术MaSp2串联体，进而重复相同的方法依次合成MaSp4，MaSp8，MaSp16，MaSp32，MaSp48，最终拼成MaSp96。步骤繁琐，费时费力。且如果想要优化蛛丝序列则需要重新合成基因，又需花费大量时间重新构建一系列串联体。

发明内容

本发明要解决的问题是如何制备串联重复蛋白质。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种制备串联重复蛋白质的方法，包括将含有名称为单拷贝基因表达盒的双链DNA分子的表达载体导入受体细胞得到重组细胞，培养所述重组细胞，表达得到串联重复蛋白质；所述单拷贝基因表达盒含有启动子，与所述启动子相连的名称为3’内含子的内含子，与所述3’内含子相连的名称为单拷贝基因的目的蛋白编码基因，与所述目的蛋白编码基因相连的核糖体结合位点(RBS)的编码序列，与所述核糖体结合位点的编码序列相连的间隔序列(Interval sequence)，与所述间隔序列相连的起始密码子，与所述起始密码子相连的名称为5’内含子的内含子；所述3’内含子和所述5’内含子满足条件A，所述条件A为在所述重组细胞中所述单拷贝基因表达盒转录出的前体RNA通过碱基互补配对形成剪接泡，并通过剪接反应产生成熟的环状单链RNA分子；所述目的蛋白编码基因不含终止密码子。

上述方法中，所述间隔序列是RBS和ATG之间的一段序列，作用是使核糖体高强度地结合到mRNA上。所述间隔序列可为4-10bp的双链DNA，如一条链的核苷酸序列是序列1的第5535-5543位核苷酸的双链DNA。

上述方法中，所述串联重复蛋白可含有2个以上的所述单拷贝蛋白，如7个拷贝以上的所述单拷贝蛋白，10个拷贝以上的所述单拷贝蛋白。

上述方法中，所述单拷贝基因表达盒由启动子，所述3’内含子、所述目的蛋白编码基因、所述核糖体结合位点的编码序列、所述间隔序列、所述起始密码子和所述5’内含子连接而成。