[发明专利]一种吕宋肽菌素C的制备方法

权利要求书

1.一种乙酰化酶基因luz27，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种吕宋马杜拉放线菌突变菌株，其特征在于，其构建方法包括：以吕宋马杜拉放线菌DSM43766为出发菌，通过基因失活技术使乙酰化酶基因luz27失活，所述乙酰化酶基因luz27的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的吕宋马杜拉放线菌突变菌株，其特征在于，采用同源双交换方法对乙酰化酶基因luz27进行基因敲除，包括如下步骤：

(1)以吕宋马杜拉放线菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的敲除区域上下游的两条同源臂，再将上下游同源臂插入穿梭质粒载体pSET152中，得到luz27的敲除载体pSET152H-△luz27；

(2)将pSET152H-△luz27转化到大肠杆菌中，再与野生型吕宋马杜拉放线菌DSM43766混合培养，筛选得到luz27缺失突变菌株。

4.如权利要求3所述的吕宋马杜拉放线菌突变菌株，其特征在于，步骤(1)中，扩增上游同源臂的引物为：

27LF：5’-agcagcAAGCTTatcacgtcgaggttgtgctcgatcacc-3’；

27LR：5’-agcagcTCTAGAaaccgctcagcacgaagaagaacga-3’；

扩增下游同源臂的引物为：

27RF：5’-agcagcTCTAGAgtgaacctggccttcaaccagctcac-3’；

27RR：5’-agcagcGAATTCcagcagcatcgtcgtggtgatgtgac-3’。

5.一种吕宋肽菌素C的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求2-4任一项所述的吕宋马杜拉放线菌突变菌株接种于发酵培养基中，发酵培养，发酵产物经分离纯化制得所述吕宋肽菌素C。

6.如权利要求5所述的吕宋肽菌素C的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为MS培养基，以质量百分比计，其成分为：2％D-甘露醇、2％黄豆粉、2％琼脂粉，余量为水。

7.如权利要求5所述的吕宋肽菌素C的制备方法，其特征在于，发酵培养条件为28～32℃培养11～13天。

8.如权利要求5所述的吕宋肽菌素C的制备方法，其特征在于，分离纯化包括：发酵结束后将包含菌体的培养基浸泡于乙酸乙酯，浸提液过滤后将乙酸乙酯蒸干得到粗浸膏，用甲醇溶解后进行葡聚糖凝胶Sephadex LH20凝胶层析，收集目标馏分，目标馏分再经YMC-C18色谱柱分离，得到目标产物。

9.如权利要求8所述的吕宋肽菌素C的制备方法，其特征在于，浸泡时间为10-12h。